豬肺炎支原體PCR快速檢測方法的建立和應用

李天芝，于新友，沈志強，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

豬肺炎支原體PCR快速檢測方法的建立和應用

李天芝1，于新友1，沈志強1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

根據豬肺炎支原體P36基因序列，設計1對引物，建立了豬肺炎支原體PCR診斷方法，該方法對豬肺炎支原體的擴增結果為陽性，對照菌株擴增結果均為陰性，對豬肺炎支原體檢測的靈敏性為1 pg總DNA量。并用建立的PCR診斷方法檢測52份豬肺炎支原體疑似病料，檢出陽性病例18份，以上結果表明該PCR方法特異性強敏感性高、簡便、快速，可用于豬肺炎支原體疾病的診斷。

豬肺炎支原體；PCR；診斷

豬肺炎支原體（Mhp）可引起豬支原體肺炎（MPS），該病又叫豬霉形體肺炎或豬氣喘病，是豬的一種高發性、慢性呼吸道傳染病，主要臨床表現為咳嗽和氣喘，一年四季均可發病，但以冬、春寒冷季節較常見，各種日齡豬均可發病，但死亡率低，病豬生長緩慢，飼料利用率低，給世界各國養豬業造成了重大的經濟損失[1-2]。豬肺炎支原體傳統的檢測方法主要有病原分離[3]、核酸探針[4]、間接血凝試驗[5]和ELISA[6]等方法這些方法有的操作繁瑣，診斷時間長，結果重復性不好，有的難以檢測出微量病毒，不適宜疾病早期診斷，本研究設計了針對豬肺炎支原體P36基因的引物，優化PCR反應體系，建立檢測了豬肺炎支原體的PCR檢測方法，并用該方法對所采集的病料進行檢測分析。

1 材料與方法

1．1 菌種和病料

豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌由本實驗室分離、保存。病料采自山東省各地豬場臨床診斷為豬支原體肺炎的豬肺臟。

1．2 主要試劑及儀器

pMD18-T載 體、Premix Taq、DL2000 Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自北京百泰克生物技術有限公司，PCR儀購自BIO-RAD公司。

1．3 引物設計與合成

參照GenBank發表的Mhp P36（X67286） 基 因 序 列， 用Primer primer5．0軟件設計1對引物，P1：5'-G ATTAGTGTCTCCCGTTAT-3'，P2：5'- TCACCCATCACGTAGGCC -3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1．4 PCR模板制備

參照百泰克細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取豬肺炎支原體基因組DNA，并提取其他幾種細菌的DNA作為模板。

1．5 豬肺炎支原體P36基因的PCR擴增及條件優化

以基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25 μL，對各擴增條件進行優化，包括退火溫度(45～55 ℃梯度溫度，每2 ℃為1個梯度)、引物濃度(0．1～1．1 μmol/L，每0．2 μmol/ L為1個梯度)等，最終確定的擴增程序為95 ℃預變性5 min，然后進入95 ℃30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃30 min循環，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL產物，1．5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外成像。

1．6 PCR擴增產物的檢測及鑒定

首先取擴增產物5 μL在1．5%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統掃描進行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于4 ℃過夜連接，轉化感受態菌株DH5α。挑取單個的轉化菌落，加LB溶液培養18 h后用質粒提取試劑盒抽提質粒DNA用PCR方法進行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定。將測序結果與參照的豬肺炎支原體P36基因序列同源性比較。

1．7 特異性試驗

分別提取豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌的DNA，用已建立的方法進行擴增。

1．8 敏感性測定

豬肺炎支原體的基因組DNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的細菌基因組DNA使其分別相當于含有100 ngDNA、10 ngDNA、1 ngDNA、100 pgDNA、10 pgDNA、1 pgDNA、0．1 pgDNA的含量，分別進行PCR檢測，確定其敏感性。

1．9 重復性試驗

用建立的PCR檢測方法，對豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌DNA，重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1．10 臨床樣品的檢測

對52份豬肺炎支原體疑似病料，用本試驗優化建立的PCR反應體系進行檢測，對擴增產物全部進行測序鑒定，并利用生物學軟件BLAST進行序列分析。

2 結果與分析

2．1 擴增產物的檢測

PCR擴增產物經過1．5%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物在351 bp處可見特異性DNA擴增條帶，與預期大小相符（圖1）。測序結果顯示擴增的序列與參照的豬肺炎支原體P36基因（X67286）的同源性為100%。

2．2 特異性試驗

利用所設計的引物及所確定的最佳反應條件分別對豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌的DNA進行PCR檢測。結果7菌株中只有豬肺炎支原體能擴增出相應的片段，大小分351 bp(預期的為351 bp)，而其他均未擴增出相應的片段（圖2）。說明本研究建立的方法特異性好。

圖1 豬肺炎支原體擴增結果

圖2 特異性試驗

圖3 敏感性試驗

2．3 敏感性試驗

取5μL PCR產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約351 bp附近出現特異性條帶，與預期產物大小相符。從結果可以看出，該PCR檢測靈敏度可以達到1 pgDNA（圖3）。

2．4 重復性試驗

經過3次重復操作，結果一致，說明建立的方法是穩定、可靠的。

2．5 檢測方法的應用

用本試驗優化建立的PCR方法對52份豬肺炎支原體疑似病料進行檢測，4 h內可出結果，檢出陽性病例18份，陽性率為34．6%。

3 討論

本實驗參照Genbank中豬肺炎支原體P36基因序列，在其高度保守區設計1對特異性引物，建立了豬肺炎支原體PCR診斷方法。通過對豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、豬胸膜肺炎放線桿菌的擴增表明，本試驗所建立的PCR檢測方法特異性高，敏感性試驗結果表明，該PCR檢測豬肺炎支原體靈敏度可以達到1 pgDNA。

國內外有關豬肺炎支原體臨床病例方面的報道較多，而病原菌檢測方法的報道卻很少。由于該病傳統的實驗室檢測方法(病原分離與生化鑒定等)繁雜費時，且檢出率較低。本實驗優化條件建立的豬肺炎支原體PCR檢測方法，直接從病料提取細菌DNA，不需要進行病原菌的分離培養，進行PCR擴增，即可判斷是否患有豬肺炎支原體感染，該方法具有檢測速度快、特異性強、敏感性高等優點。對52份臨床疑似病料進行檢測，4 h內可出結果，檢出陽性病例18份，檢出率為34．6%；用傳統的實驗室檢測方法耗時數天，說明PCR方法較傳統方法有檢測速度快，靈敏度高的優點，能對該病進行有效診斷。本試驗建立的豬肺炎支原體PCR檢測方法可用于該病的快速診斷與流行病學調查。

[1] 辛彩云，譯．國際防制豬支原體肺炎會議報告簡介[J]．國外畜牧科技，2001，28(3)：45．

[2] 沈青春，寧宜寶，覃青松．豬肺炎支原體的研究進展[J]．中國獸藥雜志，2003，37(6)：26-30．

[3] 孔令增，劉艷芬，劉鈾．廣東豬肺炎支原體的分離與鑒定[J]．中國獸醫科學，2013，43(10)：1016-1020．

[4] 李桂蘭，張映，邵國青．豬肺炎支原體斑點雜交檢測方法的建立及應用[J]山西農業大學學報(自然科學版)，2012，32(6)：536-539．

[5] 張順鳳．間接血凝試驗及豬氣喘病檢測[J]．甘肅畜牧獸醫，1996，26(1)：5-7．

[6] 劉茂軍，靳岷，杜改梅，等．檢測豬肺炎支原體抗體間接ELISA方法的建立[J]．江蘇農業學報，2007，23(5)：437-441．

2015-08-07）

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-06-011-14)

李天芝(1985-)，女，漢族，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究。