酶聯免疫法測定飼料中鹽酸克倫特羅

邢 磊，王仁華

(1.江西省獸藥飼料監察所，南昌 330029；2.江西農業大學，南昌 330045)

酶聯免疫法測定飼料中鹽酸克倫特羅

邢 磊1，王仁華2*

(1.江西省獸藥飼料監察所，南昌 330029；2.江西農業大學，南昌 330045)

當前關于檢測飼料中鹽酸克倫特羅的方法主要有酶聯免疫法（ELISA）。本試驗的目的是為了檢驗酶聯免疫法（ELISA）對飼料中鹽酸克侖特羅檢測的準確性。試驗結果表明：酶聯免疫法回收率為86.48%～95.54%，測得的試驗數據繪制的標準曲線圖的R為0.994，酶聯免疫法具有操作簡便、分析速度快、靈敏度高、成本低，適合大批量樣品的快速篩選。

鹽酸克倫特羅；酶聯免疫法；飼料

鹽酸克倫特羅(clenbuterol，簡稱CLB)是一種β-類的腎上腺類神經興奮劑，添加于飼料中能有效地促進動物體蛋白質沉積、促進脂肪分解抑制脂肪沉積，有明顯的促生長和提高瘦肉率的作用，但如果在飼料中超量使用，使得人食用CLB殘留畜產品后對人體具有很強的毒副作用，因此，鹽酸克倫特羅的準確測定顯得極為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

ELISA試劑盒、離心機、微量震蕩器、酶標分析儀、移液槍、分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 樣品的準備

對于固相樣品的前處理，分別稱取飼料0.5 g，放入4只離心管中并編號1、2、3、4號，在2、3、4號管中分別加入0.4、0.2、0.1 mL的克倫特羅標準品（濃度為100 ng/mL）；再往4個離心管里分別加入0.01M鹽酸溶液5 mL，充分混勻放在微量振蕩器上振蕩，并用1 mol/L氫氧化鈉溶液調到pH到7.5±0.5，在每分鐘5 000 轉離心機中離心5 min。取出200μL上清液加入已經按照1：10的比例稀釋好的800μL樣品稀釋工作液，振蕩均勻（放在微量振蕩），靜置。取50μL用于檢測。

1.2.2 檢測過程

確認樣品已完成前處理，試劑盒中的試劑以及酶標板都已回溫充分，從微板上取下所需數量的微孔（將多余的微孔重新封存），在微孔板上進行編號，標記標準品A1 2-F1 2和樣品的位置，進行雙孔平行實驗。在標準孔中加入50 uL鹽酸克倫特羅的標準液，濃度 分 別是：0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ng/mL，取50 μL飼料樣品溶液注入各樣品孔中；用新的吸頭配合8道移液槍和加樣槽使用，立即在所有孔中加入100 μL的酶標物工作液，注意要正確操作確保將吸頭中的液體排空，輕輕晃動反應板幾秒鐘，在22～25 ℃ 條件下孵育30 min（孵育過程中要不時輕拍震蕩酶標板，可減少雙孔誤差，提高檢測準確性）；倒掉微孔中的液體，在微孔中加入用去離子水按1：20（1+19）稀釋好的清洗液250 μL，輕輕敲動反應板，然后倒掉微孔中的液體，重復上一步驟，3遍，總共洗板4次，然后將反應板倒扣在吸水紙上拍干，用吸耳球徹底清除掉微孔中的殘留液和氣泡，清洗程序完成后（立即進行下一步驟，切勿讓微孔干燥）。用8道移液槍和加樣槽配合使用立即向每個微孔中加入100 μL顯色劑，晃動反應板使之混勻，在22～25 ℃條件下顯色10 min，用8道移液槍和加樣槽配合使用，加100 μL的終止液于每個微孔中，微孔中的顏色由藍色變成黃色，將酶標儀調至450 nm檢測吸光度，結果要在10 min內讀取才有效。實驗結束后將沒有用完的試劑裝回試劑盒封存于2～8 ℃的冰箱中。

2 結果與計算

2.1 實驗結果

酶標儀讀數的結果見表1。

表1 酶標儀讀數

2.2 繪制標準曲線

通過測得的6個標準品的吸光度值來繪制ELISA標準曲線，結果均由Romer Log/Logit軟件計算得出。根據標準曲線的參數作出標準曲線圖1。

2.3 樣品及回收率測定結果

依據標準曲線得出的飼料樣品中鹽酸克倫特羅含量及陽性添加回收率見表3。

在回收率測定試驗中，空白對照組檢測出鹽酸克倫特羅的含量為0.03 ng/ mL低于檢測限表明未檢出。該豆粕樣品的成分較復雜，可能含有與鹽酸克倫特羅結構相似的化學成分，引起交叉反應，致使結果出現偏差。在計算回收率時把差值去除即可，測定的回收率在86.48%～95.54%之間。本實驗中飼料樣品檢測限為10 μg/kg。實驗結果表明本次實驗檢測的誤差較小，所得結果準確可靠。

表2 標準曲線參數

圖1 ELISA標準曲線

3 實驗結果分析與討論

實驗結束后，若板孔顯示的顏色較淡，原因可能有：試劑盒超過有效期，移液器計量不夠準確，洗板及加樣過程中，酶標受污染，影響催化劑顯色劑顯色的能力，洗板次數過多，洗滌沖擊力太大。若重復性不好，原因可能是：樣品加入后未混勻，洗滌不正確，移液器加酶或顯色劑不均。ELISA實驗靈敏度較高，因此操作中的各個步驟對實驗的檢測效果影響較大，稍不注意，就有可能影響測試結果。因此，實驗過程必須嚴格按照要求進行操作。

表3 回收率實驗結果

使用試劑盒前必須仔細閱讀說明書，嚴格按照要求進行操作，終止液、顯色劑有刺激性，請勿接觸皮膚，試劑盒在不使用時，需放置在2～8 ℃干燥保存，不能置于0 ℃以下的冰箱中保存，并確保在有效期之前使用。在使用前，所有試劑及試劑盒內的材料必須室溫22～25 ℃回溫1 h以上，一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準確度。實驗結果的準確度與操作是否規范合理有很大的關系，因此在實驗操作過程中必須嚴格按照實驗步驟進行，不要改變分析步驟和中斷任何程序，規范使用移液槍不可有氣泡，加樣時不能加到孔璧上，每次加樣移取不同濃度的標準品，都要更換吸頭，避免交叉吸取污染標準品，試劑盒使用過程中無需使用蓋板膜，無需避光反應，應保證樣品萃取液的pH在6.75±0.25。pH過高或過低均會影響檢測結果，不能將任何未使用的或用剩的試劑倒回原裝瓶中，檢驗過程中應分清樣品與標準品的位置，在檢驗的整個過程中，任何時候都禁止搖動微孔板以防止微孔內的液體混合。實驗中加樣過程要快，盡量使前后孔的溫育時間保持一致。溫育時間要控制準確。

實驗結束后應在規定的時間內完成讀數，否則將影響實驗結果的準確性。

4 總結

本實驗用ELISA法檢測飼料中的鹽酸克倫特羅含量，該方法特異性高、靈敏度高、穩定性好、快速簡便，并可同時對多份樣品進行快速檢測，有較好的應用前景。ELISA因其檢測試劑盒檢測數量大（一般為96孔板），通常用作大規模樣品篩選是目前較常用的檢測手段。由測得的試驗數據繪制的標準曲線圖的R為0.994，測定的回收率在86.48%～95.54%之間。以此數據表明本次實驗準確性較高，實驗數據可靠。酶聯免疫法為飼料產品以及畜產品的安全提供了保障，此方法值得推廣。

2015-07-10)

王仁華，高級實驗師。