探究乙醇－丙酮不同比例對雨生紅球藻中蝦青素提取速率的影響

李小慧，鄒 寧，孫東紅，張 軍 (魯東大學生命科學學院，山東煙臺264025)

雨生紅球藻是一種廣泛分布在淡水的綠藻，有營養細胞、厚壁孢子兩種。前者是綠色的，處于生長狀態，不產生蝦青素，只有在劣勢條件下厚壁孢子才能夠開始積累類胡蘿卜素，其中80%以上為蝦青素［1］。在雨生紅球藻中，70%的蝦青素以單酯的形式存在，25%以二酯存在，而只有約5%為游離蝦青素［2］。目前，雨生紅球藻的研究及其應用受到微藻研究界的重視，但是雨生紅球藻的養殖、生產遠遠不能滿足市場需求，而且雨生紅球藻投入大規模工業生產，其培養和提取過程中尚存在許多問題亟待研究和解決。

蝦青素(Astaxanthin，3，3’－ 二羥基 －4，4’－ 二酮基 －β，β’－胡蘿卜素，C40H52O4)是一種類胡蘿卜素含氧衍生物，具有超強的抗氧化活性，同時賦予蝦青素特殊的生理功能，即提高動物免疫力，抑制腫瘤，清除自由基和活性氧等［3］。目前蝦青素生產工藝主要有化學合成和生物提取2種，但化學合成的蝦青素在結構、功能、應用和安全性等方面均較天然蝦青素遜色不少，美國FDA已明文禁止化學合成的蝦青素進入保健品市場。動物和人體試驗的結果已證明，天然蝦青素無任何毒副作用，對人體絕對安全。天然蝦青素具有廣泛的應用價值，不僅可以用作珍貴水產動物養殖的餌料添加劑和人類的食品添加劑，而且在藥品、化妝品和高級營養保健品等領域也具有巨大的應用潛力。在特定條件下，雨生紅球藻可以積累占其干重1%以上的蝦青素，且所含蝦青素的結構與養殖對象所需的蝦青素結構一致，因此，雨生紅球藻被公認為天然蝦青素的最好生物來源［4］。同時，利用雨生紅球藻生產蝦青素已成為國內外蝦青素研究的熱點［5－6］。

雨生紅球藻的培養過程存在不易生長和易染菌等問題，其色素的提取過程也較困難。常用方法包括有機溶劑提取、植物油提取［7］及超臨界二氧化碳萃取［8－10］等。植物油提取雖然安全性較高，但植物油沸點高，后期不易分離和處理;超臨界二氧化碳提取法是較流行的方法，但其成本較高［11］。有機溶劑法具有易操作、控制，且易分離，甚至可以重復利用等優點，所以目前工業生產中分離提取蝦青素主要采用有機溶劑法。該種方法成本低、效率高。在蝦青素的提取過程中，有機溶劑從雨生紅球藻細胞中萃取蝦青素的原理是有機溶劑通過細胞壁進入細胞，使得色素溶解于有機溶劑中，從而通過擴散作用進入溶液。這是一種固—液萃取的過程。雨生紅球藻的細胞壁很厚且存在膠質，阻礙了提取劑向細胞內滲透，因此加大了從其中提取蝦青素的難度。

在有機溶劑法中，較成熟的是采用丙酮作為提取劑，也是目前常用的有機溶劑中提取率較高的，但是丙酮的毒性大，且提取過程中易揮發，因此，筆者研究丙酮與乙醇不同比例提取蝦青素的方法，并且比較不同比例提取的雨生紅球藻蝦青素提取物的提取率，以期探索提取雨生紅球藻中蝦青素較安全、毒性小、有效的有機溶劑。

1 材料與方法

1.1 材料 供試雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)的新鮮藻液由魯東大學大境藻類研究所提供。

1.2 蝦青素提取及測定方法 取樣，測定蝦青素基礎量。用分光光度計在可見光λ400～700 nm處測定OD值，并且通過計算得出蝦青素含量。經多次蝦青素吸光度的標定，在波長為473 nm處蝦青素的吸光度達到峰值，因此，試驗中蝦青素的吸光度均在波長473 nm下測定(理論值為475 nm)。

蝦青素含量的測定步驟為:①將冷凍的新鮮藻膏提前放入保鮮里，用電子天平稱取8支離心管，并且編號1～8，分別記下其質量M1～M8，用移液管分別吸取少量新鮮藻膏，置于潔凈的離心管中，再次分別稱量其質量M1’～M8’，并且計算出M’與M的質量差即鮮藻膏的質量;②向1～8號離心管中分別加入有機溶劑1 ml，再加入少量(8～12個)玻璃珠，在振蕩混勻器上振蕩混勻，在振蕩混勻過程中用鋁箔包住離心管，邊振蕩邊觀察，振蕩完成后再加入2 ml提取劑振蕩混勻，提取過程需進行3次，以保證充分提取出雨生紅球藻細胞中的蝦青素，在不同比例的試驗中均用乙醇和丙酮兩管作對照，剩下不同試驗中分別為1∶1(V/V)、2∶1(V/V)、1∶2(V/V);③先將提取液1～8號離心管放入80℃的水浴中加熱1 min，冷卻至室溫后轉移到0～4℃的條件下冰浴1 h;④將冰浴后的提取液在4 000 r/min的條件下離心5 min，取上清液，分別轉移至1～8號10 ml定容管中;⑤重復②～④步驟3次，將3次提取的上清液合并，每次分別移入相同編號的定容管中，并且定容至10 ml，混勻，在波長400～700 nm的可見光范圍內測定其吸光度，并且記錄所測得的數值;⑥不同比例的各試驗重復5次，然后將1∶1、2∶1、1∶2丙酮放在 1個試驗中，重復5次。

1.3 蝦青素含量的計算方法 在473 nm波長下測定最大吸光度值，以提取劑作為空白對照。如果吸光度值大于1.25，則必須對樣品用提取劑稀釋后再測，稀釋倍數一般為1∶7。用下列公式計算所測溶液中蝦青素含量:若原料為新鮮藻類培養液，則用蝦青素(mg/L)=［4×OD(λ473)×丙酮的體積］/藻液的體積，葉綠素(mg/L)=［12.7×OD(λ664)－2.69×OD(λ647)］×稀釋倍數;若原料為新鮮藻膏，則用蝦青素(mg/g)=［4×OD(λ473)×丙酮的體積］/(鮮藻膏的質量×藻膏的干重)。

1.4 新鮮藻膏干重的測定方法 將稱量紙置于培養皿中，于80℃下烘干12 h至恒重，記錄稱量紙的質量(m1);用膠頭滴管吸取藻液，同樣置于培養皿中，于80℃下烘干12 h至恒重，記錄其質量(m2)。

鮮藻的干重公式為:m=m2－m1

采用該方法最終測得所用鮮藻的平均干重為(103.6±0.52)mg/g。

1.5 蝦青素的吸收光譜 蝦青素在不同的分光光度計下的最大吸收波長不同，所以在采用此分光光度計測定蝦青素含量時，需要對蝦青素的最大吸收波長的結果進行校對。采用分光光度計測定蝦青素在可見光范圍內的吸光光度值。經測定，發現當波長為473 nm(理論值為475)時吸收光譜達到最大。

2 結果與分析

由圖1可知，乙醇/丙酮為1∶2(V/V)時蝦青素的提取率為 15.59 mg/g，丙酮的提取率為15.06 mg/g，乙醇/丙酮為1∶1(V/V)時提取率為12.72 mg/g，乙醇/丙酮為2∶1(V/V)時提取率為12.47 mg/g，乙醇的提取率為 10.11 mg/g。由此可知，乙醇/丙酮為1∶2(V/V)時提取率最高，其次為丙酮。

研究表明，乙醇/丙酮為1∶2(V/V)時提取率最高。用添加乙醇來降低丙酮單獨作提取劑的毒性，與丙酮作提取劑時蝦青素的提取率要高，雖然與丙酮作有機溶劑相比不是特別顯著，但仍達到預期效果，與乙醇作提取劑相比提高近50%倍，效果還是很明顯的。

圖1 不同比例有機溶劑提取率比較

目前，對蝦青素的提取主要是通過有機溶劑浸提的方法。該方法操作簡便易行，成本低，后期易分離和獲取。常用有機溶劑是丙酮，其操作較完善和成熟。在此基礎上進行的改進使得試驗更具說服力。雨生紅球藻在不良條件下才開始產生蝦青素，同時為了度過劣勢環境會產生厚壁孢子。在提取蝦青素時加入丙酮和乙醇。丙酮是極性較強的溶劑，蝦青素溶解度較低，親水性溶劑乙醇滲入細胞中將蝦青素溶解到有機溶劑中，從而提高提取效率，因而選擇乙醇和丙酮混合作有機溶劑來提取雨生紅球藻中的蝦青素。這也是比較理想的有機混合溶劑。

3 結論與討論

有機溶劑通過細胞壁滲入細胞，使得蝦青素溶解在有機溶劑中，并且通過擴散作用進入有機溶劑的溶液中。這是一種固－液萃取的過程。含有蝦青素的細胞是厚壁細胞。細胞壁太厚，有膠質層，便會影響有機溶劑分子進入細胞，同時影響蝦青素溶液的擴散效果［12］。因此，試驗前必須先進行破壁處理，破壞其細胞機構，從而利用有機溶劑將蝦青素提取出來，大大提高其提取效率。

試驗中，用新鮮藻膏為原料，干重為103.6 mg/g，濃度較新鮮藻液要高，提取效率有所提高，但新鮮藻膏也保存在冷凍環境。在每次試驗前，都要提前將其放入保鮮環境融化，或置于室溫，但要注意避光，以防止蝦青素被氧化，造成試驗誤差。該研究對有機溶劑的比例進行優化，優化后效果明顯。當乙醇/丙酮為1∶2時效果最明顯，是乙醇作有機溶劑的1.5倍多，也較丙酮作有機溶劑時的效果要好些，從而篩選出最佳配比。乙醇無毒，能降低丙酮作溶劑毒性，具有更大優勢。這兩種溶劑均易獲取，而且操作簡便易行。在整個試驗中，一定要注意控制溫度、避光，以免使蝦青素被氧化，影響提取效果。試驗所用乙醇和丙酮這兩種提取劑的原料廉價易得，也沒有增加后續分離操作的困難，最重要的是提取效果更好。

該研究對有機溶劑比例的優化具有實際應用價值，既降低生產成本，又提高生產效率，降低毒性，提升提取率，比丙酮和乙醇單獨作提取劑有更大的優勢。這對日后大規模生產具有參考價值。

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