具有漆酶活性細(xì)菌的鑒定及芽孢漆酶對(duì)染料脫色的研究

蘇詩(shī)茜，孫海瓊，劉少楠，蘇秋鈺，崔岱宗*

(1.黑龍江省實(shí)驗(yàn)中學(xué)，黑龍江哈爾濱150001;2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種多銅氧化酶，能夠?qū)⒀鯕膺€原為水，同時(shí)介導(dǎo)芳環(huán)化合物的氧化。漆酶對(duì)底物的特異性低，能氧化多種污染物，在廢水處理和生物修復(fù)方面具有很大的潛力［1］。工業(yè)生產(chǎn)的條件比較苛刻。在高溫、極酸或極堿的環(huán)境下［2］，要求有極高穩(wěn)定性的漆酶。與細(xì)菌漆酶相比，雖然真菌漆酶氧化還原能力較強(qiáng)，產(chǎn)量較高［3］，但是其穩(wěn)定性比較低，pH范圍比較窄，而且活性易受鹽溶液的影響［4］。近年來(lái)，細(xì)菌漆酶以其固有的熱和堿性pH穩(wěn)定性作為具有潛力的生物催化劑而被廣泛研究［5］。

染料被應(yīng)用于紡織、皮革、醫(yī)藥、化妝品和塑料工業(yè)。大多數(shù)染料由于其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有毒性，并且不易被降解。工業(yè)上的染料廢水對(duì)人類的健康有很大的危害［6］。采用生物酶法處理染料廢水比采用物理、化學(xué)方法處理具有節(jié)約成本的優(yōu)勢(shì)［7］。漆酶能使多種合成染料脫色［8］，對(duì)環(huán)境污染的治理具有潛在的意義。筆者從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的土壤中分離出一株具有漆酶活性的新菌株。它對(duì)三苯甲烷類和蒽醌類染料具有較高的脫色率。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株10`ZS由從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)樟子松林下的土壤中分離。

1.2 方法

1.2.1 菌株10`ZS的形態(tài)學(xué)及生理生化反應(yīng)特性。菌株10`ZS的革蘭氏染色和糖類分解、明膠液化及硝酸鹽還原等生理生化特性測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。細(xì)菌的16S rDNA通用引物27F:5`-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3`(M=A+C)和1492R:5`-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3`(Y=C+T)［10］，由華大基因公司合成。以CTAB法提取的菌株10`ZS的總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，20 μl反應(yīng)體系組成為:10 ×Taq反應(yīng)緩沖液2 μl，10 mmol/L的 dNTP 0.4 μl，5 μmol/L 的上、下游引物各 4 μl，3 U/μl的Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，DNA 模板1 μl，ddH2O 8.4 μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度1.0%瓊脂糖凝膠分離后，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收，將回收的目的片段與pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送華大基因公司對(duì)菌株10`ZS的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，選取同源性較高的序列，利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Phylip軟件的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)特性的研究。將菌株10`ZS分別在25、30、35和40℃條件下培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將菌株10`ZS在 pH 分別為5.0、6.0、7.0和8.0的條件下培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將菌株10`ZS分別接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、4%和6%NaCl的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究NaCl溶液對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將菌株10`ZS分別接種到 Cu2+濃度為 0、0.2、0.4 和 0.6 mmol/L 的 LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液的OD600，研究Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。重復(fù)3次。

1.2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對(duì)染料脫色的研究。芽孢漆酶懸液的制備、漆酶活性的測(cè)定方法及芽孢漆酶對(duì)染料的脫色方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［11］。活性亮藍(lán)(RBBR)、活性黑、靛紅和結(jié)晶紫分別屬于蒽醌、偶氮、靛藍(lán)和三苯甲烷類染料。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株10`ZS的形態(tài)學(xué)及生理生化反應(yīng)特性 菌株10`ZS革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，具有芽孢。菌株10`ZS能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇，具有明膠酶(表1)。

表1 菌株10`ZS的生理生化反應(yīng)特性

2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 由圖1可知，菌株10`ZS的16S rDNA擴(kuò)增條帶清晰，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增片斷，大小在1.5 kb左右，其測(cè)序結(jié)果為1 451 bp。將菌株10`ZS的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源性分析，它與芽孢桿菌屬同源性達(dá)99%。結(jié)合該菌株的形態(tài)和生理生化特性，將其命名為Bacillus sp.10`ZS。利用Clustal X軟件對(duì)菌株10`ZS、其他菌株的的16S rDNA進(jìn)行多序列比對(duì)，用Phylip軟件的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。

圖1 菌株10`ZS的16S rDNA PCR結(jié)果

圖2 基于菌株10`ZS的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株10`ZS的生長(zhǎng)特性 由圖3可知，菌株10`ZS的最適生長(zhǎng)溫度是35℃，在25～40℃之間生長(zhǎng)良好。由圖4可知，菌株10`ZS的最適生長(zhǎng)pH為6.0，適宜在pH 5.0 ～8.0 生長(zhǎng)。由圖5可知，菌株10`ZS在1% ～4%NaCl溶液中正常生長(zhǎng)，在6%NaCl溶液中生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。由圖6可知，菌株10`ZS在0.2 ～0.4 mmol/L 的 Cu2+溶液中正常生長(zhǎng)，在 0.6 mmol/L的Cu2+溶液中生長(zhǎng)緩慢。

圖3 溫度對(duì)菌株10`ZS生長(zhǎng)的影響

圖4 pH對(duì)菌株10`ZS生長(zhǎng)的影響

2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對(duì)染料的脫色效果 以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計(jì)算，菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7 U/g。由圖7可知，菌株10`ZS的芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫、RBBR、靛紅和活性黑6 h脫色率分別為87.9%、78.5%、16.1%和 14.6%。

3 討論

圖5 NaCl對(duì)菌株10`ZS生長(zhǎng)的影響

圖6 Cu2+對(duì)菌株10`ZS生長(zhǎng)的影響

圖7 菌株10`ZS芽孢漆酶對(duì)4種染料的脫色效果

菌株10`ZS是從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的樟子松林下的土壤中分離出來(lái)的，有芽孢，在pH 5.0～8.0的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，能夠耐受6%NaCl溶液。這些特性使得這株細(xì)菌適用于工業(yè)廢水的處理。菌株10`ZS能夠耐受0.6 mmol/L的Cu2+。這是它得以在Cu2+作為篩選劑的培養(yǎng)基中被分離出的原因。以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計(jì)，菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7U/g，稍低于Bacillussp.CLb［11］和Bacillus sp.9BS［12］的芽孢漆酶的活性。

菌株10`ZS的芽孢漆酶在6 h內(nèi)對(duì)三苯甲烷類染料結(jié)晶紫和蒽醌類染料RBBR的脫色率較高，分別為87.9%和78.5%。蒽醌類染料是漆酶的特異底物，可以直接被氧化［13］，而三苯甲烷類染料不是漆酶的特異底物，但是菌株10`ZS的芽孢漆酶則可以直接氧化結(jié)晶紫使其脫色，表明菌株10`ZS的芽孢漆酶具有新的功能。綜上所述，菌株10`ZS具有耐鹽和耐銅的性能，在6 h內(nèi)芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫和RBBR具有較高的脫色效果。這表明菌株10`ZS的芽孢漆酶在工業(yè)染料廢水的處理中具有潛力。

［1］CLAUS H，F(xiàn)ABER G，K?NIG H.Redox-mediated decolorization of synthetic dyes by fungal laccases［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，59:672-678.

［2］SANTHANAM N，VIVANCO J M，DECKER S R，et al.Expression of industrially relevant laccases:Prokaryotic style［J］.Trends Biotechnol，2011，29:480-489.

［3］DWIVEDI U N，SINGH P，PANDEY V P，et al.Structure-function relationship among bacterial，fungal and plant laccases［J］.J Mol Catal B:Enzym，2011，68:117-128.

［4］FANG Z M，LI T L，CHANG F，et al.A new marine bacterial laccase with chloride-enhancing，alkaline dependent activity and dye decolorization ability［J］.Bioresour Technol，2012，111:36-41.

［5］SINGH G，BHALLA A，KAUR P，et al.Laccase from prokaryotes:A new source for an old enzyme［J］.Rev Environ Sci Biotechnol，2011，10:309-326.

［6］SHARMA J K，ARORA M K.Decolourization of textile effluent［J］.Pollution Res，2001，20:453-457.

［7］DURA’N N，DURA’N M.Enzyme applications in the textile industry［J］.Rev Progress Coloration，2000，30:41-44.

［8］WESENBERG D，KYRIAKIDES I，AGATHOS S N.White rot fungi and their enzymes for the treatment of industrial dye effluents［J］.Biotechnol Adv，2003，22:161-187.

［9］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.3版.北京:高等教育出版社，1999:116-120.

［10］王遠(yuǎn)亮，楊瑞紅，毛愛(ài)軍，等.采用未培養(yǎng)技術(shù)對(duì)荷斯坦奶牛瘤胃細(xì)菌多樣性進(jìn)行初步分析［J］.微生物學(xué)報(bào)，2005，45(6):915-919.

［11］李凡姝，劉海洋，戴紹軍，等.高產(chǎn)漆酶菌株Bacillus sp.CLb的篩選及其對(duì)染料脫色效果的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(6):1614-1616，1654.

［12］汪春蕾，田菲，張?jiān)路f，等.耐鹽Bacillus sp.9BS的篩選及其對(duì)染料的脫色效果［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，41(3):313-317.

［13］WONG Y，YU J.Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes［J］.Water Res，1999，33:3512-3520.