松茸濃縮口服液制備過程中醇溶性物質的提取研究*

么宏偉，佟立君，付婷婷**，謝晨陽，吳洪軍，趙鳳臣，馮 磊，張學義

（1.黑龍江省林副特產研究所黑龍江省非木質林產品研發重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省林業科學院，黑龍江 哈爾濱 150081）

〈貯運加工〉

松茸濃縮口服液制備過程中醇溶性物質的提取研究*

么宏偉1，佟立君2，付婷婷1**，謝晨陽1，吳洪軍1，趙鳳臣1，馮 磊2，張學義1

（1.黑龍江省林副特產研究所黑龍江省非木質林產品研發重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省林業科學院，黑龍江 哈爾濱 150081）

本實驗是松茸口服液制備醇溶性物質提取部分。將超聲波輔助水提取和弱堿鹽溶液提取后的殘渣用乙醇溶液提取，以多酚和三萜的總提取率為檢測指標，對提取的條件進行了探討。研究表明，提取的最優工藝為乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃，在此條件下多酚和三萜的得率分別為1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

松茸；多酚；三萜

松茸Tricholoma matsutake(S.Ito et Imai)Sing.，又名松口蘑，與溫帶和寒溫帶的松林與櫟林共生生長，為共生菌[1]。野生松茸的生長環境極為苛刻，需要依賴柏樹、橡樹等闊葉林為其生長發育提供營養支持，才能形成健康的子實體[2-3]。松茸含有豐富的氨基酸、維生素、脂肪膳食纖維和多種活性酶，另含有3種珍貴的活性物質，分別是雙鏈松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸具很多保健功能，如提高免疫力、抗癌抗腫瘤、治療糖尿病及心血管疾病、抗衰老養顏和促腸胃保肝臟等[6-8]。本課題以新鮮松茸為原料，利用超聲波輔助水提、弱堿鹽溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的營養物質，并制備成了松茸濃縮口服液。本試驗打破了松茸在傳統口服液中利用率低的局限性，通過改變提取方式，增加了松茸濃縮液的提取率，并結合口服液具有使用簡單、方便，便于保藏等優勢，大大提高了松茸的利用價值與經濟效益。其中采用醇提取法提取松茸中的多酚及三萜。在實驗中對乙醇濃度、提取時間、提取溫度三個因素進行正交試驗和分析，確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗所需松茸來自黑龍江省牡丹江市東寧縣。

1.2試驗試劑

檸檬酸、正丁醇、肉豆蔻酯、EDTA、檸檬酸鈉、纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、碳酸鈉、氯化鈉、95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、草酸、維生素C、偏磷酸、醋酸、氯酸銨、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、磷酸、沒食子酸、福林酚、熊果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑均為國產分析純。

1.3試驗儀器與設備

主要試驗儀器見表1。

表1 主要試驗儀器Tab.1 Main laboratory apparatus

1.4試驗方法

1.4.1 原材料預處理

選擇新鮮、無病殘、無蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水。將松茸子實體進行切片處理，用電子天平稱重，加入20倍體積無菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有0.03%的檸檬酸、0.02%正丁醇與0.02%肉豆蔻酯的混合溶液中，減壓浸漬10 min。加入0.02%EDTA、0.2%檸檬酸鈉，用組織搗碎器將組織破壞。加入纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，按6.8 g·L-1加入，3種酶的比例為1∶1∶1.4。

1.4.2 醇溶液提取工藝的優化

（1）醇溶液提取工藝的優化

為得到松茸中的醇溶性成分，將超聲波輔助水提取和弱堿鹽溶液提取后的殘渣用乙醇溶液提取，以多酚和三萜的總提取率為檢測指標。

以多酚和三萜的總提取率為檢測指標，稱取超聲波輔助水提取和弱堿鹽溶液提取后的殘渣50 g，分別改變提取條件（乙醇濃度、提取時間和提取溫度）的三個因素，考察各因素對總提取率的影響，各因素水平設置如下：

乙醇濃度：50%、60%、70%、80%、90%；提取時間：30 min、60 min、90 min、120 min、150 min；提取溫度：50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

在上述單因素實驗的基礎上，運用L9（33）正交表，由乙醇濃度、提取時間、提取溫度作正交表，因素水平表如表2。

表2 醇溶液提取工藝的正交試驗Tab.2 Orthogonal experiment design of alcohol solution extraction

（2） 醇溶液物質總得率的計算

多酚標準曲線的繪制：精確稱取沒食子酸標準品25 mg，用水溶解并定容至250 mL，得到0.1 mg·mL-1的標準溶液。精密吸取標準溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于 100 mL容量瓶中，加入1 mL福林酚顯色劑，搖勻后再加入2 mL15%碳酸鈉溶液，定容至100 mL，室溫下反應2 h后于760 nm處測吸光值，以沒食子酸濃度（μg·mL-1） 為橫坐標，以吸光值（OD760） 為縱坐標，如圖1所示。

圖1 多酚標準曲線Fig.1 Polyphenols standard curve

多酚得率的計算：取1 mL提取液，按照上述標準曲線方法測定吸光值，根據標準曲線求出提取液中多酚的濃度，可計算多酚得率（P），公式為：

P=M1/M0×100%

式中：M1表示提取液中多酚質量；M0表示松茸質量。

三萜標準曲線的繪制：精確稱取熊果酸標準品1.150 mg，溶于10 mL無水乙醇中，得0.115 μg·mL-1標準溶液。精確吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL標準溶液于10 mL試管中，水浴蒸干溶劑。分別向每支試管中加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL、高氯酸1 mL，密封。60℃水浴加熱15 min，取出置于冰水中冷卻。再向每支試管中加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻。于548 nm處測吸光值，以熊果酸質量（μg）為橫坐標，以吸光值（OD548）為縱坐標，如圖2所示。

圖2 三萜標準曲線Fig.2 Triterpenoids standard curve

三萜得率的計算：取1 mL提取液，按照上述標準曲線方法測定吸光值，根據標準曲線求出提取液中多糖的濃度，可計算三萜得率（P1），公式為：

P1=M2/M0×100%

式中：M2表示提取液中三萜質量；M0表示松茸質量。

2 結果與分析

2.1醇溶液提取最佳工藝的確定

2.1.1 乙醇濃度對醇溶性成分總得率的影響

在一定范圍內，隨著乙醇濃度的增加，醇溶性物質的得率也呈上升趨勢，說明乙醇濃度可以改變醇溶性物質的得率。結果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對醇溶性物質總得率的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on the rate of alcoholsoluble substances gotta

由圖3可知，醇溶性成分的總得率在乙醇濃度為80%時達到最大。乙醇濃度小時，松茸中的醇溶性物質并沒有完全溶解到溶液中；而乙醇濃度大時可能會導致醇溶性成分結構破壞或物質變性影響得率。所以，以乙醇濃度80%為宜。

2.1.2 提取時間對醇溶性成分總得率的影響

提取時間會對醇溶性物質的得率產生影響，提取時間過長，會導致得率降低。結果如圖4所示。

圖4 提取時間對醇溶性物質總得率的影響Fig.4 Extraction time on the overall yield of the alcohol-soluble substances

由圖4可知，醇溶性成分的總得率在提取時間為60 min時達到最大。提取時間少時，不能將松茸中的醇溶性物質完全提取出來；而提取時間多時可能會導致醇溶性成分結構破壞影響得率。所以，以提取時間60 min為宜。

2.1.3 提取溫度對醇溶性成分總得率的影響

溫度可能會對醇溶液提取過程中乙醇的揮發及醇溶性物質的結構產生影響，結果如圖5所示。

圖5 提取溫度對醇溶性物質總得率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction of alcohol-soluble substances gotta rate

由圖5可知，隨著提取溫度的變化，醇溶性成分的總得率變化不大，在70℃時達到最大。所以，以提取溫度70℃為宜。

2.1.4 醇溶液提取工藝正交試驗

醇溶液提取總提取率正交設計試驗因素水平表及方差分析表見表3、表4。

表3 醇溶液提取總提取率正交設計試驗因素水平表Tab.3 Alcohol solution to extract total extraction rate orthogonal design factor level

表4 醇溶液提取總提取率方差分析表Tab.4 Alcohol solution to extract total extraction rate analysis ofvariance table

通過極差分析，得到因素顯著性主次順序為提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度。比較試驗結果可以得出三因素的最佳組成為：乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃。表4的方差分析結果表明，提取時間對乙醇溶液提取的影響達到顯著水平（p＜0.05）。

在最佳工藝條件下測得乙醇提取液中多酚和三萜的得率分別為1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

醇溶液提取的最佳工藝為：乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃。

3 小結

松茸中的醇溶性成分（多酚和三萜）最佳提取工藝為乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃，此時多酚和三萜的得率分別為1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

[1]Byeon SE,Lee J,Lee E,et al.Functional activation of macrophages,monocytes and splenic lymphocytes by polysaccharide fraction from Tricholoma matsutake[J].Archives of Pharmacal Research,2009,32(11):1565-1572.

[2]Ding X,Tang J,Cao M,et al.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Tricholoma matsutake [J].International Journal of Biological Macromolecules,2010,47(2):271-275.

[3]Kim SS,Lee JS.Process development formycelial growth and polysaccharide production in Tricholoma matsutake liquid culture[J].Journal of Bioscienceand Bioengineering,2010(3): 351-355.

[4]Yin XL,You QH.Immunomodulatory activities of different solvent extracts from Tricholoma matsutake(S.Ito et S.Imai) Singer(Higherbasidiomycetes)on normal mice[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2012(14):547-554. [5]You QH,Yin XL.Pulsed counter-current ultrasound-assistedextraction and characterization of polysaccharides from Boletus edulis[J].Carbohydrate Polymers,2014(101):379-385.

[6]You QH,Yin XL.Extraction purification and antioxidant activities of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai [J].Carbohydrate Polymers,2014(99):1-10.

[7]You QH,Yin XL.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit of Cornus officinalis[J].Carbohydrate Polymers,2013(98):607-610.

[8]劉培貴，袁明生，王向華.松茸群生物資源及其合理利用與保護[J].自然資源學報，1999（3）：245-252.

Extraction of Alcohol-soluble Substances in the Process of the Preparation of Condensed Oral Liquid of Tricholoma matsutake

YAO Hong-wei1,TONG Li-jun2,FU Ting-ting1,XIE Chen-yang1, WU Hong-jun1,ZHAO Feng-chen1,FENG Lei1,ZHANG Xue-yi1
(1.Heilongjiang Forest By-Product and Speciality Research Institute,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development,Mudanjiang 157011,China;2.Heilongjiang Academy of Forestry,Harbin 150081,China）

Extraction of alcohol-soluble substances was a part from preparation of condensed oral liquid of Tricholoma matsutake.The material which use alcohol solution to extract was the residue from water ultrasonic-assisted extraction and weak alkali salt extraction.The content of polyphenols,triterpenoids of Tricholoma matsutake were evaluated.The alcohol solution extraction technology were also discussed.The results showed that ethanol concentration was 80%,extraction time was 30 min and extraction temprature was 70℃,under the optimum conditions the content of polyphenols,triterpenoids were reached at 1.16 mg/100g and 0.23 g/100g.

Tricholoma matsutake;polyphenols;triterpenoids

S646.9

A

1003-8310（2015）02-0070-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.018

黑龍江省森林工業總局科技攻關項目（sgzjY2012022）。

么宏偉（1981-），男，在讀碩士研究生，助理研究員，主要研究方向為林產化學加工學。E-mail:meme917@163.com

**通信作者：付婷婷（1985-），女，碩士，研究實習員，主要從事林產化學加工學方面研究。E-mail:futingting115@126.com

2015-01-15