環磷酰胺對大鱗副泥鰍免疫抑制的研究

陳亞軍， 李 義， 徐 樂， 凌去非， 葛星星

（蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123）

免疫功能正常的水產動物對病原的入侵具有較強的抵抗力，只有當機體免疫功能低下而又遭遇病原時才會患病。因此，免疫增強劑更適用于免疫功能低下的水產動物。但是，目前通常是將免疫增強劑給予正常的水產動物后測定其免疫應答水平，依據免疫水平的提高來評定免疫增強劑的效果。實際上，對于免疫功能正常者，會因機體自身免疫系統存在調節作用而掩蓋免疫增強劑的真實效果（陳勇等，2005；華雪銘等，2004）。因此建立水產動物免疫抑制模型對水產動物免疫增強劑的研發具有重要的理論與實際意義。

環磷酰胺（CYP）是一種免疫抑制劑，常用于建立免疫抑制模型。目前，應用環磷酰胺已成功建立了暗紋東方鲀（華雪銘等，2004）、異育銀鯽（陳勇等，2005）、蟾胡子鲇（Kumari和 Sahoo，2005）、雜色鮑（王廣軍等，2008）、建鯉（李其繁，2009）、黃鱔（閆琳，2010）及中華絨螯蟹（王玉芬等，2014；李義等，2014）等水產動物的免疫抑制模型。但是，由于水產動物的種類較多，免疫抑制模型的通用性較差，并且，目前有關泥鰍免疫抑制模型的研究鮮見報道。因此本文報道環磷酰胺對大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）免疫抑制的試驗結果，旨在為泥鰍免疫增強劑的研發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 大鱗副泥鰍，購自蘇州奧博鰍業有限公司，外觀健康，平均體重為（16.33±0.12）g。

1.1.2 試劑與基礎飼料 環磷酰胺 （CYP），為Sigma公司產品；紅細胞數 （RBC）、白細胞數（WBC）、補體 C3、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、考馬斯亮藍法蛋白定量測定試劑盒及溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）凍干粉，均為南京建成生物工程研究所產品；超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）含量與丙二醛（MDA）含量測定試劑盒，均為蘇州科銘生物技術有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。基礎飼料由本實驗室自制，不含有免疫增強劑和免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 泥鰍經過1周暫養后，隨機分組飼養于16只35cm×37.5cm×20cm的圓形塑料桶內，每只桶放養18尾。養殖期間投喂基礎飼料，水溫控制在（25±0.5）℃，按常規方法進行飼養管理。試驗設3個CYP組（Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組）和1個對照組，每個處理組設4個重復。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別以 100、200、300 mg/kg體重的劑量腹腔注射CYP，對照組注射等量的0.85%滅菌生理鹽水。

1.2.2 樣本采集 在注射CYP后第8天自每個養殖桶中隨機采取3尾泥鰍，斷尾取血并采集肝胰臟，按常規方法分別制成抗凝血、血清及肝胰臟勻漿上清液備用。

1.2.3 免疫指標的測定 RBC、WBC、血清NO含量、補體C3含量、ACP與AKP活性、肝胰臟SOD活性及MDA含量的測定，參照試劑盒所述方法適當修改后進行。血清LSZ活性的測定參照Hultmark和Seiner（1980）的方法適當修改后進行。以溶壁微球菌凍干粉為底物，用0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液將底物配成一定濃度的菌懸液（OD570nm=0.3），取3 mL菌懸液與0.1 mL待測血清于試管中混勻，用分光光度計測定570nm處的初始吸光值（A0），然后置于37℃水浴30 min，取出后立即置于冰浴中（10 min）終止反應，測定吸光值（A）。 LSZ 活性（U）=（A0-A）/A。

1.3 統計分析 數據用統計軟件SPSS18.0進行單因素方差分析，并用Duncan’s檢驗法進行均值間多重比較。P>0.05為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 環磷酰胺對大鱗副泥鰍外周血紅細胞數和白細胞數的影響 由表1可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的RBC和WBC分別降低45.5%、56.3%、73.5%和 78.0%、59.4%、81.0%（P ＜ 0.05）；Ⅲ組的RBC分別較Ⅰ、Ⅱ組降低51.5%和39.5%（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅱ組之間差異不顯著 （P>0.05）；Ⅰ組和Ⅲ組的WBC分別較Ⅱ組降低45.9%和53.1%（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著降低大鱗副泥鰍外周血中的紅細胞數和白細胞數，以300 mg/kg體重劑量的作用效果最佳。

2.2 環磷酰胺對大鱗副泥鰍血清一氧化氮含量的影響 由表1可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的血清NO含量分別增加216.0%、52.0%、144.0%（P＜0.05）；Ⅰ組和Ⅲ組的血清NO含量分別較Ⅱ組增加107.9%和60.5%（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著提高大鱗副泥鰍血清NO含量，以100 mg/kg體重劑量的作用效果最佳。

2.3 環磷酰胺對大鱗副泥鰍血清補體C3含量的影響 由表1可知，Ⅲ組的血清補體C3含量分別較對照組、Ⅰ組和Ⅱ組降低48.6%、42.8%和35.8%（P＜0.05）；Ⅰ組、Ⅱ組和對照組3個組的血清補體C3含量無顯著差異（P>0.05）。上述結果表明，腹腔注射試驗劑量的CYP均能降低大鱗副泥鰍血清補體C3含量，300 mg/kg體重劑量的作用最顯著。

2.4 環磷酰胺對大鱗副泥鰍血清溶菌酶活性的影響 由表1可知，Ⅱ、Ⅲ組的血清LSZ活性分別較對照組和Ⅰ組降低47.8%、52.2%和40.0%、45.0%（P＜0.05）；Ⅰ組與對照組、Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結果表明，腹腔注射200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著降低大鱗副泥鰍血清LSZ活性，以300 mg/kg體重劑量的作用效果較佳。

2.5 環磷酰胺對大鱗副泥鰍血清磷酸酶活性的影響 由表1可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的血清ACP活性分別降低33.1%、41.1%和29.0%，AKP活性分別降低 55.2%、60.3%和 47.9%（P＜0.05）；3個CYP組的血清ACP和AKP活性無顯著差異（P>0.05）。上述結果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著降低大鱗副泥鰍血清ACP和AKP活性，均以200 mg/kg體重劑量的作用效果最佳。

表1 環磷酰胺對大鱗副泥鰍9種免疫指標的影響

2.6 環磷酰胺對大鱗副泥鰍肝胰臟超氧化物歧化酶活性的影響 由表1可知，Ⅰ組和Ⅱ組的肝胰臟SOD活性與對照組和Ⅲ組相比，分別增加44.8%、91.0%和 75.1%、131.0%（P ＜0.05）；Ⅱ組的肝胰臟SOD活性比Ⅰ組增加31.9%（P＜0.05）；Ⅲ組的肝胰臟SOD活性低于對照組，但兩組之間無顯著差異（P>0.05）。由此可見，腹腔注射100、200 mg/kg體重的CYP對大鱗副泥鰍肝胰臟SOD活性均具有顯著的增強作用，以200 mg/kg體重劑量的作用效果較佳；腹腔注射300 mg/kg體重的CYP對泥鰍肝胰臟SOD活性具有一定的抑制作用。

2.7 環磷酰胺對大鱗副泥鰍肝胰臟丙二醛含量的影響 由表1可知，Ⅰ組和Ⅲ組的肝胰臟MDA含量與對照組和Ⅱ組相比，分別顯著增加47.3%、50.8%和 33.9%、37.0%（P<0.05）；Ⅱ組與對照組、Ⅰ組與Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結果表明，腹腔注射100和300 mg/kg體重的CYP均能顯著提高大鱗副泥鰍肝胰臟MDA含量，以300 mg/kg體重劑量的作用效果較佳。

3 討論

紅細胞數與白細胞數是反映機體免疫狀況的常用指標。研究表明，腹腔注射一定劑量的環磷酰胺可顯著降低小鼠（Wang等，2011）和建鯉（李其繁，2009）的RBC與WBC。本試驗結果表明，對大鱗副泥鰍腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的環磷酰胺后第8天，RBC與WBC均顯著下降。這與本研究結果相一致。

NO作為一種自由基，在動物體內發揮著生理和病理的雙重作用。一方面可抑制和殺滅病原微生物，參與機體抗感染免疫和防御；另一方面大劑量的NO可產生細胞毒性作用，損傷正常組織細胞（沙愛龍等，2013）。本試驗結果顯示，對大鱗副泥鰍腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的環磷酰胺后第8天，血清NO含量均顯著增加，表明試驗劑量的環磷酰胺可能已導致泥鰍出現了免疫抑制及組織損傷。推測出現上述結果的機制可能是泥鰍在受到環磷酰胺刺激后，誘導型NO合成酶（iNOS）mRNA的表達增加，從而導致血清NO含量明顯增加。陳炅然等（2005）發現，腹腔注射100 mg/kg體重的環磷酰胺可使小鼠胸腺NO水平顯著上升，這與本試驗結果一致。

補體系統是魚類免疫系統的重要組成部分，其中補體C3含量的高低反應機體免疫功能的強弱。已有研究表明，環磷酰胺能顯著降低小鼠（沈赤等，2015；廖呂燕等，2010）和建鯉 （李其繁，2009）血清補體C3含量。本試驗結果顯示，腹腔注射300 mg/kg體重的環磷酰胺能顯著降低泥鰍血清補體C3含量，這與本研究結果一致。

溶菌酶是生物體內重要的非特異性免疫因子，其通過水解細菌細胞壁的肽聚糖而發揮溶菌作用。ACP和AKP是動物體內水解酶體系和解毒體系中的兩種重要酶類，對機體的免疫功能具有積極的影響。已有研究表明，注射環磷酰胺可顯著降低建鯉和黃鱔的血清LSZ活性（閆琳，2010；李其繁，2009）；顯著降低建鯉和中華絨螯蟹血清ACP 和 AKP 活性（王玉芬等，2014；閆琳，2010）。這與本試驗結果一致。

SOD活性的高低在一定程度反映了機體清除氧自由基的能力，MDA含量則反應了機體脂質過氧化的程度，間接反映細胞損傷的程度。已有研究表明，注射環磷酰胺能使小鼠肝組織中的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加（Jnaneshwari等，2013；柯春林等，2011）。本試驗結果顯示，對大鱗副泥鰍注射試驗劑量的環磷酰胺后第8天，100、300 mg/kg組的肝胰臟MDA含量顯著高于對照組；100、200 mg/kg組的肝胰臟SOD活性顯著高于對照組，300 mg/kg組則低于對照組。這與上述研究結果基本相同。至于本試驗中泥鰍肝胰臟SOD活性的表現，也許可用 “毒物興奮效應”（Stebbing，1982）來解釋。

4 結論

對大鱗副泥鰍腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的環磷酰胺，可使其免疫功能受到不同程度的抑制。從總體上看，以300 mg/kg體重劑量的作用效果最好，該劑量可用于構建環磷酰胺誘導的大鱗副泥鰍免疫抑制模型。

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