EPO聯合BMSCs治療對大鼠脊髓損傷修復的影響

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(南華大學附屬第一醫院脊柱外科，湖南 衡陽 421001)

·基礎醫學·

EPO聯合BMSCs治療對大鼠脊髓損傷修復的影響

謝中，羊明智*，胡文凱，彭立軍，劉騫

(南華大學附屬第一醫院脊柱外科，湖南 衡陽 421001)

目的研究骨髓間充質干細胞(BMSCs)與促紅細胞生成素(EPO)聯合應用對大鼠脊髓損傷修復的影響。方法將80只SD大鼠隨機分成手術對照組(n=15)、EPO治療組(n=15)、BMSCs治療組(n=25)和BMSCs聯合EPO治療組(簡稱聯合組、n=25)。造模后第7天EPO組大鼠經腹腔注射EPO,BMSCs組、聯合組大鼠則經損傷脊髓局部注射BMSCs和局部注射BMSCs的同時加用EPO腹腔注射。應用雙標免疫熒光法檢測5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記的神經元中絲蛋白(NF-M)的表達情況；取脊髓組織作HE染色觀察脊髓損傷及恢復程度；用(BBB)法檢測大鼠神經功能的恢復情況。結果聯合組較BMSCs移植治療組炎性細胞浸潤和組織水腫顯著減輕。移植的BMSCs在宿主脊髓中存活，聯合組中NF-M陽性細胞數目均比其余組多(P<0.05)。聯合組在不同的時間點神經功能BBB評分都較BMSCs組及EPO組高。結論BMSCs移植與EPO腹腔注射是治療大鼠脊髓損傷的有效方法；BMSCs與EPO聯合應用對脊髓損傷修復具有協同作用。

促紅細胞生成素； 間質干細胞； 脊髓損傷； 移植； BBB評分； 神經功能恢復

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經系統的一類嚴重創傷，其高致殘率和死亡率成為脊柱外科工作者急需解決的難題。近年來隨著神經生物學的飛速發展，細胞移植成為治療脊髓損傷最有希望的方法之一[1]。從目前的資料來看，BMSCs(Bone mesenchymal stem cell，BMSCs)具有多向分化潛能[2]、極大的可塑性[3]、強大的增殖能力[4]、高度的遷移性等特點[5]成為理想的細胞移植治療和基因治療的首選細胞。促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種多功能神經營養因子和保護因子，具有調節中樞神經系統發育、營養神經和保護神經的作用，是一個新的具有廣闊發展前景的神經保護劑[6]。本實驗通過對Allen’s大鼠脊髓損傷模型局部進行BMSCs移植的同時加用EPO腹腔注射，研究局部移植BMSCs在脊髓損傷修復中的作用，并探討EPO與BMSCs聯合應用對大鼠脊髓損傷修復的影響以及EPO在大鼠體內是否可以誘導BMSCs向神經細胞分化，為治療脊髓損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1動物、試劑及儀器80只健康SD青年大鼠，清潔級，體重220±10 g，均購于湖南省人民醫院中心實驗室。重組促紅細胞生成素，2000 IU/支，由沈陽三生制藥有限責任公司生產(批號：1001032)。DAB顯色劑(武漢博士德生物有限公司)，BrdU(廣州市銳博生物有限公司)，鼠抗神經元中絲蛋白單抗(美國Neomaekers公司)，小鼠抗BrdU抗體(武漢博士德生物有限公司),蘇木素伊紅染液(重慶東方制藥廠),YPS-2000系列彩色病理圖文分析(德國萊卡公司),ZMN-6802病理組織溶烘儀(常州市華利電子公司),LeicaRM2016切片機(上海來卡儀器),YB-6D生物組織石蠟包買機(湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司)。

1.2分組及給藥方法80只SD大鼠隨機分為4組：對照組、EPO治療組、BMSCs治療組、BMSCs聯合EPO治療組。對照組大鼠于造模后第7天在損傷脊髓局部注射5 μL BMSCs培養液；EPO治療組于造模后第7天按2 000 lU/kg腹腔注射EPO進行治療；BMSCs治療組于造模后第7天在損傷脊髓局部注射5 μL BMSCs懸液進行治療；BMSCs聯合EPO治療組(簡稱聯合組)于造模后第7天在損傷脊髓局部注入5 μL BMSCs懸液，同時按2 000 lU/kg腹腔注射EPO治療。對照組、EPO組各15只大鼠，BMSCs組、聯合組各25只。

1.3 BMSCs的移植[7]大鼠脊髓損傷模型建立后第7天，把培養液加入5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記過的第3代BMSCs(由中南大學國家重點遺傳學實驗室提供)，將細胞濃度調至5×104～1×105個/μL的范圍內待用。用微量注射器將5 μL經BrdU標記的BMSCs細胞懸液緩慢注入BMSCs組及聯合組大鼠損傷脊髓臨近區域的灰白質交界處。

1.4行為學檢測移植治療后1天,7天，14天，21天，28天，各組取10只大鼠置于寬闊的地板上，在雙盲法的前提下觀察其雙側后肢各關節運動的范圍和數量，根據雙下肢步態是否協調以及運動程度進行運動功能評分(BBB)[8]，并作記錄，對所得數據進行重復測量的方差分析。

1.5動物取材及陽性細胞的判定和計數對照組、EPO組21天時隨機選5只大鼠取標本做常規HE染色及神經元中絲蛋白(neurofilament-M,NF-M)免疫組化，光鏡下觀察組織病理學的變化。BMSCs組及聯合組3天、7天、21天時隨機選5只大鼠取標本行Brdu+NF-M雙標免疫熒光，另取21天時標本做常規HE染色及NF-M免疫組化。在400倍光鏡下，隨機計數相應時間點5個視野中Brdu和NF-M雙染，NF-M單染陽性細胞，取其平均值。

2 結 果

2.1大鼠脊髓損傷行為學檢測(BBB評分) 治療后第7天、14天、21天和28天時，EPO組、BMSCs組及聯合組的BBB評分比對照組明顯升高，且聯合組的神經功能改善明顯高于EPO組和BMSCs組，見表1。

表1各組大鼠各個時間點BBB評分表(分)

組別第1天第7天第14天第21天第28天對照組3.05±0.124.57±0.236.68±0.288.12±0.3610.12±0.35EPO組3.35±0.146.45±0.28ab8.67±0.34ab12.42±0.52ab14.83±0.54abBMSCs組3.38±0.246.56±0.32ab8.92±0.24ab13.16±0.44ab15.14±0.67ab聯合組3.56±0.199.14±0.38a12.16±0.43a15.71±0.65a17.68±0.86a

與對照組比較，a:P﹤0.05；與聯合組比較，b：P<0.05

2.2脊髓組織HE染色檢查結果移植后21天，手術對照組(圖1A)有較多空腔，白質中有許多微囊，神經纖維及細胞壞死，在挫傷處附近形成較多空泡；聯合組(圖1B)脊髓組織在高倍鏡下觀察可見脊髓組織中無明顯空腔，空泡小而少，色澤較亮，膠質細胞增生活躍，脊髓有許多增生組織填充，損傷脊髓周圍能見到較完整的神經細胞；EPO組(圖1C)和BMSCs組(圖1D)神經纖維及細胞變性、壞死的程度和數量較重。

圖1 治療后第21天各組大鼠脊髓組織恢復情況(HE染色×200) A：對照組；B：EPO組；C：BMSCs組；D：聯合治療組

2.3 Brdu與NF-M雙標免疫熒光染色結果聯合組(圖2A)與BMSCs組(圖2B)脊髓組織內均可見到BrdU標記的陽性細胞存在，聯合組中BrdU標記的陽性細胞數目比BMSCs組多；從移植后的第7天可以檢測到BrdU和NF-M雙標染色陽性的細胞。聯合組(圖2C)中BrdU和NF-M雙標染色陽性的細胞數較BMSCs組(圖2D)多(P<0.05)。

圖2 BrdU和NF-M雙標染色陽性的細胞分布(免疫熒光×400) A：聯合治療組治療第3天；B：BMSCs組治療第3天；C：聯合治療組治療第7天；D：BMSCs組治療第7天

2.4 NF-M免疫組化結果對照組(圖3A)可見少量免疫反應陽性的神經纖維，較小，也可見少量膠質細胞活躍增生，突起細而短；EPO組(圖3B)與BMSCs組(圖3D)可見較多的染色陽性的神經纖維，少量長入瘢痕內，膠質細胞增生較對照組多；而EPO加BMSCs聯合應用組(圖3D)可見大量染色陽性的神經纖維，較多的長入瘢痕內，星形細胞出現明顯的功能活躍，肥大，突起增多。治療組陽性細胞數目較對照組明顯增多；聯合組陽性細胞數目比EPO組、BMSCs組明顯增多(P<0.05)。

圖3 各組治療后21天NF-M表達情況(DAB×400) A：對照組；B：EPO組；C：BMSCs組；D：聯合治療組

3 討 論

研究表明BMSCs移植能有效促進損傷脊髓功能的恢復[9-10]。BMSCs保護神經的作用機制可能是:(1)BMSCs可以分泌NGF等神經營養因子，促進神經遞質的生成和軸突生長，對受損的神經細胞起保護作用與修復作用[8]；(2)移植的BMSCs可作為軸突再生的支架，引導軸突向前生長，抑制癱痕形成，建立新的突觸聯系，重建神經通路；(3)BMSc可以促進新生血管的生成與血管重建，改善受損神經的血供，為受損神經提供營養[8];(4)免疫調控作用:BMSc可以通過自身免疫過程，阻止免疫損傷，對神經起保護功能[11]；(5)BMSc減輕細胞凋亡水平，激活休眠狀態的神經細胞，促進神經恢復[12]。

傳統認識中，EPO被認為是一種促進紅細胞增殖，糾正貧血的內分泌激素。近來EPO已被實驗證實是一種新型的神經保護劑[13]。EPO通過與促紅細胞生成素受體結合而發揮其神經保護作用，其作用機制有以下幾點：(1)EPO在早期可以維持損傷脊髓的血供，并可以促進局部血管的生成，提高損傷脊髓對缺血、缺氧的耐受性[14]；(2)EPO可以通過減少神經細胞的凋亡，減少神經功能缺失，并能抑制局部的炎癥反應，為脊髓的恢復創造有利的局部內環境[15]；(3)EPO是一種神經營養因子，可以促進神經系統的發育，增加神經元的生成[16]。研究表明NF-M在神經細胞的氧化應激后表達發生明顯的改變，可通過穩定細胞骨架和抑制軸突回縮而促進軸突延長，起到促進神經功能恢復的作用[17]。

本實驗中治療后第21天,對照組較多空腔，神經纖維及細胞變性壞死。聯合組脊髓組織脊髓組織中無明顯空腔，脊髓有許多增生組織填充，損傷脊髓周圍能見到較完整的神經細胞；聯合組可見更多的NF-M陽性細胞，明顯多于EPO、BMSCs單獨治療組。再結合各組的BBB評分與組織學觀察可見聯合組神經損傷凋亡明顯減輕，神經軸突再生顯著增多，神經功能明顯好轉；機制可能為EPO與BMSCs表達的EPO受體結合后動員BMSCs進入損傷區;此外，EPO為移植的BMSCs創造有利于生存的局部內環境，促進BMSCs分化為神經元細胞，替代死亡的神經細胞，分泌大量的NF-M穩定細胞骨架，促進軸突再生、再通，促進神經功能恢復。EPO調節局部血管，維持供血及供氧，兩者共用具有協調作用。

總之，脊髓損傷的再生修復是一個多因素參與的復雜過程，是一個世界性的難題。原因之一是因為缺乏合適的微環境，限制了損傷神經軸突的再生。EPO能改善損傷局部的微環境，抑制細胞凋亡，有利于移植的BMSCs在體內存活、分化增加，促進神經系統的發育。EPO與BMSCs聯合移植后，增加了存活細胞及分化為神經元細胞的數量，替代變形凋亡的神經元細胞，促進軸突的再生與再通，促進神經功能的恢復。EPO與BMSCs聯合治療具有協同效應。

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*通訊作者，E-mail:Mingzhiyang@126.com

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(此文編輯：蔣湘蓮)