外排泵adeB基因與鮑曼不動桿菌多重耐藥的關系

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(1.南華大學附屬第一醫院輸血科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫院檢驗科)

·基礎醫學·

外排泵adeB基因與鮑曼不動桿菌多重耐藥的關系

陽志勇1，尹文君2，謝海濤2，張秋桂2

(1.南華大學附屬第一醫院輸血科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫院檢驗科)

目的探討臨床分離鮑曼不動桿菌主動外排基因adeB的表達與其多重耐藥的關系。方法對臨床分離的64株鮑曼不動桿菌采用紙片擴散法檢測對抗菌藥物的敏感性；羅丹明6G檢測外排活性，RT-PCR檢測外排泵基因adeB的分布和表達水平。結果64株鮑曼不動桿菌耐0～2種抗菌藥物4株，耐3～5種抗菌藥物33株，耐6～8種抗菌藥物27株；羅丹明6G外排實驗顯示，外排增強的多重耐藥菌株其外排基因adeB的表達明顯增高。結論藥物主動外排增強與鮑曼不動桿菌多重耐藥相關；外排基因的過度表達可能是導致鮑曼不動桿菌多重耐藥的主要原因。

鮑曼不動桿菌； 多重耐藥； adeB

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,Ab)是常見的導致醫院感染的主要條件致病菌之一，廣泛存在于自然界與機體表面，當機體的抵抗力以及免疫能力低下更易導致機會感染[1-3]。近年來，隨著抗菌藥物及免疫抑制劑的廣泛應用，多重耐藥呈逐年上升的趨勢，而研究報道鮑曼不動桿菌耐藥的主要機制仍由主動外排作用所介導[1-3]。本研究通過羅丹明6G篩選出外排明顯的菌株，再通過RT-PCR檢測外排泵基因adeB的分布和表達水平，進而分析外排泵基因adeB與鮑曼不動桿菌多重耐藥之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株來源 64株臨床分離株來自2013年1月～2014年2月南華大學附屬第一醫院住院患者，標本來源主要為痰、傷口分泌物、血液、引流物、大便和尿液。

1.1.2 主要試劑及儀器 羅丹明6G購自Sigma公司；DNA Marker、RT-PCR逆轉錄試劑盒購自北京鼎國公司；Trizol試劑盒和DNA純化試劑盒均購自天根生物公司；ABI7500 Realtime PCR儀;法國VL公司凝膠成像分析系統。adeB引物：P1:5′-GTATGAATTGATGCTGC- 3′ ；P2:5′-CACTCGTAGCCAATACC- 3′； 內參照基因16sRNA：C1:5′-GGAGGAAGGTGGGGATGACG- 3′；C2:5′-ATGGTG TGACGGGCGGTGTG- 3′均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏實驗 采用法國生物梅里埃ATB藥敏系統進行藥物敏感實驗，BD CRYSTAL細菌鑒定系統進行細菌檢測，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922；金黃色葡萄球菌ATCC25923；綠膿假單胞菌ATCC27853。根據藥敏結果顯示耐藥種類的數量將64株受檢菌分為A組(耐0～2種抗菌藥物)、B組(耐3～5種抗菌藥物)和C組(耐6～8種抗菌藥物)。

1.2.2 羅丹明6G外排實驗 將單個菌落接種于LB培養基中，37℃恒溫箱培養8 h,收集2 mL在600 nm波長處的吸光值(OD600)為1.0的菌懸液，用PBS 1 mL洗滌3次。取1 mL混合PBS菌懸液，加羅丹明6 G，終濃度為5 μmol/L，放置于37 ℃震蕩儀30 min，PBS水洗。將其加入1 mL含1%葡萄糖的PBS中，37 ℃水浴震蕩儀15 min。取0.8 mL上清液測定其熒光強度。1%葡萄糖PBS溶液為空白對照。計算公式為:羅丹明6G外排活性ES=(樣本的熒光強度一空白管的熒光強度)/OD600。

1.2.3 提取DNA 于1 mL Trizol 中加入1 mL菌液，按5∶1加入氯仿，振蕩約30 S，4 ℃靜置。13 000 r/min離心10 min，取上清，加入等量的異丙醇混勻，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，再加入75%乙醇300 μL混勻，12 000 r/min離心1 min，常溫陰干10 min，加入30 μL經焦碳酸二乙酯處理過的純水。

1.2.4 DNasel消化DNA及逆轉錄 DNasel消化DNA：總RNA20～50 μg;DNase(DNase-free)2 μL;10×DNase Bufer 2 μL；10×DNase1 Bufer 5 μL；RNase Inhibitor 0.55 μL；DEPC處理水50 μL，37 ℃反應20～30 min，加入DEPC 50 μL，加入異戊醇/氯仿/苯酚(1∶24∶25)10 μL混勻，12 000 r/min離心1 min，取上清液，加入異戊醇/氯仿(1∶24)，同上離心取上清液，加入3M NaOAC(pH5.2)10 μL，加入250 μL無水乙醇，-20 ℃放置20～30 min，同上離心回收沉淀，75%乙醇清洗沉淀，同上離心回收沉淀，加DEPC20 μL處理沉淀,-70 ℃保存。

逆轉錄：按試劑盒說明加以改良進行，RP1 μL，10 mm dNTP mixture 1 μL，5×RT buffer 4 μL，酶混合液1 μL，總RNA樣品1 μL，DEPC 11 μL，30 ℃保溫10 min,37 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min,1個循環將上述逆轉錄的產物進行PCR擴增。擴增體系：25 μL，cDNA模板1 μL，adeB引物1 μL，內參引物1 μL，Master mix 12.5 μL，去離子水7.5 μL，94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,共25個循環，延伸7 min，置4 ℃保存。在同等條件下通過凝膠成像系統測定PCR產物的密度值，計算出16sRNA與adeB的密度比值。

2 結 果

2.1羅丹明6G外排實驗鮑曼不動桿菌羅丹明6G外排活性以公式ES=(樣本的熒光強度一空白管的熒光強度)/OD600為計算依據，計算出A、B、C組的外排量分別為 0.253±0.010 μmol /L (n=4)、0.570±0.021 μmol/L(n=33)、0.793±0.035 μmol/L(n=27),可見ESA

2.2總RNA檢測提取64株鮑曼不動桿菌總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果可見16 s和23 s兩個清晰的條帶，說明RNA無明顯降解(見圖1)。

2.3 adeB基因表達A、B、C三組中，A組的4株為非多重耐藥菌株，羅丹明6G外排實驗無明顯陽性，B組的33株與C組的27株為多重耐藥菌株，羅丹明6G外排實驗陽性，RT-PCR測定該三組的adeB基因的mRNA表達水平。以總DNA為模板進行逆轉錄,mRNA半定量結果示：C組表達量為2.506±0.253；B組表達量為2.152±0.186；A組表達量為1.652±0.175；可見B組和C組adeB mRNA的表達量均高于A組(見圖2，3)。

3 討 論

鮑曼不動桿菌為一類生化反應不活躍的非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，也可存在于人體體表的條件致病菌，是引起醫院感染的常見致病菌，其耐藥機制復雜，主動外排機制仍然是其耐藥的主要機制之一，經證實AdeA、B、C是鮑曼不動桿菌所特有的生物外排胞膜蛋白基因[3-6]。

圖1 鮑曼不動桿菌總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果

圖2 部分鮑曼不動桿菌adeB mRNA基因擴增圖 1～4:A組； 5～8:B組；M:marker

圖3 部分鮑曼不動桿菌adeB mRNA基因擴增圖 1～4:A組； 5～8:C組；M:marker

有機染料羅丹明6G是常用檢測微生物外排蛋白功能的一種底物，本實驗將羅丹明6G作為AdeA、B、C的作用底物，篩選出由主動外排介導的多重耐藥鮑曼不動桿菌，三組鮑曼不動桿菌對羅丹明6G外排量分別為0.253±0.010 μmol /L(A組)、0.570 ±0.021 μmol /L(B組)和0.793±0.035 μmol /L(C組)，C組的羅丹明6G外排活性最強，B組次之，三組間差異均有統計學意義。表明多重耐藥組(C組，B組)較非多重耐藥組(A組)外排程度更高，進一步提示外排泵蛋白的過度表達，易致抗菌藥物的外排增加，導致多重耐藥的產生。

RT-PCR是將PCR和RNA的反轉錄相結合的技術，并廣泛應用于基因檢測[5-7]。為了進一步研究生物外排泵蛋白B的表達水平與外排強度的相關性，本研究采用RT-PCR技術檢測該三組鮑曼不動桿菌的adeB基因的mRNA表達水平，mRNA半定量結果顯示：C組表達量為2.506±0.253；B組表達量為2.152±0.186；A組表達量為1.652±0.175，C組和B組均大于A組，C組大于B組，各組間差異均有統計學意義，說明多重耐藥菌株的羅丹明6G外排增加，其外排基因adeB的表達水平也較非多重耐藥菌株(A組)高，結果提示該菌株耐藥種類越多，其外排基因adeB的表達水平也越高。進一步證實了鮑曼不動桿菌主動外排基因的高水平表達是多重耐藥的重要耐藥機制之一。

鮑曼不動桿菌的耐藥機制復雜，由主動外排介導的多重耐藥機制仍可能是其主要的耐藥機制，外排基因的高表達能導致對多種抗菌藥物的外排，外排泵抑制劑能夠部分逆轉這種外排。因此，加強外排泵的研究，為開發更有效的外排泵抑制劑，避免藥物成為外排泵的底物，為臨床更有效地避免抗菌藥物的耐藥具有重要的意義。

[1] 匡艷華，袁秀琴.2004～2007年鮑曼不動桿菌的分布特征及耐藥性分析[J ].南華大學學報：醫學版,2008,36(5):646-648.

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[3] 張輝，張小江，徐英春，等.2011年中國CHINET不動桿菌屬細菌耐藥性監測[J]中國感染與化療雜志,2013,13(5):342-347.

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[5] 劉振茹，凌保東.鮑曼不動桿菌耐藥性與16s rRNA甲基化酶基因表達相關性研究[J].川北醫學院學報,2012,27(6):526-528

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RelationshipofMultidrugResistancewithActiveEffluxGeneadeBinClinicalIsolatesofAcinetobacterBaumannii

YANG Zhiyong,YIN Wenjun,XIE Haitao,et al

(TheFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explore the relationship of multidrug resistance with abeB gene in the clinical isolates of Acinetobacter baumannii.MethodsThe agar doubling dilution method was used to identify the minimal inhibitory concentration(MIC) of 8 antibiotics for Acinetobacter baumannii.The efflux of Rhodamine 6G in 64 strains of clinical Acinetobacter baumannii was tested and the Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA expression levels of active efflux gene adeB.ResultsAmong 64 strains of clinical Acinetobacter baumannii 4 strains was resistant to 0～2 antibiotics,33 strains was resistant to 3～5 antibiotics,27 strains was resistant to 6～8 antibiotics.The expression levels of efflux gene adeB in the multiple drug-resistant strains which enhanced the efflux were also increased.ConclusionsThe effection of active efflux system of adeB may be one of the important multidrug resistance mechanisms of Acinetobacter baumannii.

Acinetobacter baumannii; multiple resistance; adeB

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.007

2014-05-07；

2015-04-13

R378.21

A

(此文編輯：秦旭平)