小膠質細胞介導的興奮性氨基酸在大鼠DAI神經損傷中的作用

·論著·

小膠質細胞介導的興奮性氨基酸在大鼠DAI神經損傷中的作用

李苑1，2，易善勇1，王松軍1，劉霞1，齊倩1，叢斌1*

(1.河北醫科大學基礎醫學院法醫學系，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學教務處實驗診斷教研室，河北 石家莊 050017)

[摘要]目的觀察大鼠彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)模型中小膠質細胞介導的興奮性氨基酸在神經損傷中的作用。方法75只SD大鼠隨機分為假手術組、損傷組、米諾環素干預組各25只，通過免疫組織化學方法觀察DAI后6、12、24、48和72 h CD11b分布特點，并通過高效液相色譜對腦組織中的興奮性氨基酸進行定量分析。結果打擊后12 h小膠質細胞數量明顯增加，損傷組大腦皮層CD11b的表達在打擊后12 h達到高峰，腦干CD11b的表達在打擊后24 h達到高峰。給予米諾環素干預后CD11b的表達在12～72 h明顯減少。打擊后腦組織即有谷氨酸和天門冬氨酸含量升高，損傷組大腦皮層谷氨酸及天門冬氨酸12 h到達高峰，腦干組織谷氨酸和天門冬氨酸損傷后24 h達到高峰，之后逐漸下降，而米諾環素干預組12～72 h均低于損傷組。結論米諾環素可以通過抑制小膠質細胞的激活作用降低腦組織中谷氨酸及天門冬氨酸的含量。

[關鍵詞]彌漫性軸索損傷；氨基酸類；米諾環素doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.08.001

[收稿日期]2015-06-14；[修回日期]2015-07-17

[基金項目]國家自然科學基金(C2008001038)；河北省自然科學基金(H2013206138)

[作者簡介]李苑(1986-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學教務處助教，醫學碩士，從事法醫病理學研究。

通訊作者*。E-mail：cong6406@126.com

[中圖分類號]R651.1[文獻標志碼]A

Effect of microgila-induced excitatory amino acids on nerve injury in DAI rat

LI Yuan1，2,YI Shan-yong1,WANG Song-jun1,LIU Xia1,QI Qian1,CONG Bin1*

(1.Institute of Forensic Medicine,the Basic Medical School of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;

2.Institute of Laboratory Diagnostics,Academic Affairs,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)

Abstract[] ObjectiveTo explore the role of microglia-induced excitatory amino acids(EAA)- excitotoxicity in the diffuse axonal injury(DAI) rat.MethodsSeventy-five SD rats were randomly divided into Sham group,injury group and minocycline treated group,25 rats a group.Immunohistochemical technique was used to examine the expression of CD11b after DAI 6,12,24,48 and 72 h.High performance liquid chromatography was used to detect the content of glutamate and aspartate.ResultsAfter injury,the microglia obviously increased,and CD11b expression in the cortex of injury group reached the peak.CD11b expression in the brain stem peaked at 24 h after injury.After minocycline treatment,CD11b expression significantly reduced at 12-72 h.Meanwhile，glutamate and aspartate level significantly increased after injury,reached peak in the cortex at 12 h in cortex,and in the brain stem at 24 h.Later,glutamate and aspartate decreased.The glutamate and aspartate of minocycline treated group were significantly lower than those of injury group at 12-72 h after injury.ConclusionMinocycline can restrain microglia activation and decrease the expression of glutamate and aspartate in the brain to develop the therapevtice effect.

[Key words]diffuse axonal injury;amino acids;minocycline

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)是指頭部遭受鈍性特殊外力，產生加速運動時，在剪應力的作用下，腦內發生的以神經軸索腫脹、斷裂為特征的一系列的病理生理變化，已有研究發現在DAI大鼠腦組織中可見大量小膠質細胞激活，其過度激活會導致DAI后神經元“二次損傷”[1]。小膠質細胞在中樞神經系統中不僅起支持和營養作用，同時作為中樞神經系統內興奮性氨基酸代謝的重要場所，激活的小膠質細胞可釋放大量的興奮性氨基酸，而興奮性氨基酸過多產生的興奮毒性作用可以導致神經損傷[2]，目前關于小膠質細胞激活在興奮性氨基酸興奮毒性中的作用還不明確。本研究在DAI后采用小膠質細胞抑制劑米諾環素干預，初步探討DAI后小膠質細胞介導的興奮性氨基酸在腦損傷中的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組健康雄性SD大鼠75只，體質量(280±18) g，由河北省實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為假手術組、損傷組和米諾環素干預組各25只，各組根據處死時間分為打擊后6、12、24、48和72 h共5個亞組進行觀察，每亞組5只。

1.2模型的制作各組大鼠于手術前12 h禁食，自由飲水。參照 Marmarou[3]的方法制作大鼠DAI模型。假手術組給予手術及打擊前處理，不給予打擊；米諾環素干預組在打擊后腹腔注射45 mg/kg米諾環素，之后1次/d，共3 d；損傷組在相同時段腹腔注射等量的生理鹽水。米諾環素的劑量選擇參考Hewlett等[4]的米諾環素神經保護作用機制研究。

1.3CD11b免疫組織化學染色大鼠開顱取腦后去除硬腦膜，沿正中線矢狀切開，固定12 h后常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋成塊。矢狀面進行連續切片，展片后用掛有多聚賴氨酸的載玻片撈取，切片烤干后4 ℃保存備用。結果判定：CD11b陽性表達位于小膠質細胞胞膜上，陽性反應呈棕黃色。并進行半定量分析，計算積分光密度(optical density,OD)值。

1.4高效液相色譜法檢測腦組織中谷氨酸(glutamic acid,Glu)和天門冬氨酸(aspartic acid,Asp)含量將各組大鼠直接快速斷頭取腦，取大腦皮層及腦干組織稱質量，按0.1 kg/L加入無水乙醇，電動勻漿機磨成勻漿,吸出勻漿液,在18 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min,取上清液25 mL加入125 mL無水乙醇在-70 ℃冰箱凍存備用。

應用HP1090高效液相色譜儀設定柱溫40 ℃，流速0.45 mL/min，熒光檢測器設定激發波長為Ex340 nm，發射波長為Em450 nm。取樣品中的某成分峰的保留時間與標準品中相應峰的保留時間相一致者作為Glu、Asp峰。繪制標準曲線后對腦組織中的Glu、Asp濃度進行定量，并檢測該方法的精密度和回收率。

2結果

2.1CD11b免疫組織化學結果觀察損傷組打擊后12 h小膠質細胞數量明顯增加，呈棕褐色，突起變粗、變短，胞體增大、變圓，主要分布于損傷軸索及小血管的周圍；大腦皮層CD11b的表達在打擊后12 h達到高峰，腦干CD11b的表達在打擊后24 h達到高峰，之后逐漸減少。與損傷組比較，米諾環素干預組小膠質細胞數量明顯下降，細胞變小。

假手術組在6～72 h內小膠質細胞激活程度雖有波動，但基本上比較平穩；損傷組在受打擊后6～72 h小膠質細胞激活程度均明顯高于假手術組(P<0.05)，且在12 h達高峰，以后逐漸降低；米諾環素干預組在受打擊后6 h與損傷組差異無統計學意義，仍在12 h達高峰，但與損傷組已明顯降低(P<0.05)，且在24、48和72 h均明顯低于損傷組(P<0.05)。見表1，2，圖1，2。

2.2Glu及Asp的測定

2.2.1標準曲線的制作本研究應用高效液相色譜法對大腦皮質和腦干組織的Glu和Asp的含量進行測定。Glu保留時間為5.584 min，定量線性方程為y=77.615 84x+7.534 52。Asp保留時間為3.740 min，定量線性方程為y=94.472 84x+1.056 43。精密度試驗結果：Glu和Asp遷移時間相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)分別為0.79%、1.1%;峰面積的RSD分別為5.1%、4.7%。回收率試驗結果：Glu的回收率為97.5%(RSD=2.1%，n=5)；Asp的回收率為94.1%(RSD=3.5%，n=5)。見表3。

2.2.2各組大腦皮層部位Glu、Asp測定結果假手術組大腦皮層和腦干Glu濃度在6～72 h內雖有波動，但基本上較平穩；損傷組在6～72 h內，大腦皮層和腦干中Glu濃度較假手術組均有明顯升高(P<0.05)，Glu在大腦皮層12 h、在腦干24 h達高峰，以后逐漸下降；米諾環素干預組在大腦皮層和腦干6 h與損傷組差異無統計學意義(P>0.05)，但在12、24、48和72 h較損傷組均明顯降低(P<0.05)。

假手術組大腦皮層和腦干中Asp濃度在6～72 h內雖有波動，也基本較平穩；損傷組在6～72 h內，大腦皮層和腦干Asp濃度較假手術組明顯升高(P<0.05)，Asp在大腦皮層12 h、腦干24 h達高峰，以后逐漸下降；米諾環素干預組在大腦皮層和腦干6 h與損傷組差異無統計學意義(P>0.05)，但在12、24、48和72 h較損傷組明顯降低(P<0.05)。見表4。

表1　3組大腦皮層部位小膠質細胞表達比較

* P<0.05與假手術組比較　# P<0.05與損傷組比較( q檢驗)

* P<0.05與假手術組比較　# P<0.05與損傷組比較( q檢驗)

表43組不同時點大腦皮層和腦干Glu、Asp變化

Table 4Level of Glu,Asp in crotex and brain stem in three groups

組別大腦皮層Glu的濃度6h12p4p8h72h假手術組 15.73±1.5314.78±1.1113.89±1.0316.47±1.3115.86±0.93損傷組 31.49±4.89*37.21±3.41*30.18±3.62*24.83±2.48*21.43±2.14*米諾環素干預組27.86±3.63*28.99±4.01*#25.11±2.04*#20.34±3.31*#18.11±1.73#F 25.9130.6674156.87813.950413.959P 0.0000.0000.0000.0010.001組別腦干Glu的濃度6h12p4p8h72h假手術組 9.34±1.149.46±1.279.45±1.349.75±1.539.51±1.24損傷組 22.04±2.45*29.75±2.63*31.97±3.16*26.09±2.97*14.65±2.64*米諾環素干預組20.76±3.39*22.52±3.38*21.41±3.49*#19.00±2.29*#11.42±1.93#F 39.02179.52079.52761.4368.270P 0.0000.0000.0000.0000.006組別大腦皮層Asp的濃度6h12p4p8h72h假手術組 2.14±0.252.62±0.292.16±0.152.46±0.262.44±0.31損傷組 8.77±1.39*10.78±1.43*8.68±1.17*6.77±1.034*5.83±1.23*米諾環素干預組7.70±1.30*8.52±0.93*#6.65±0.91*#4.92±0.88*#3.52±0.98#F 63.61888.59375.40636.49617.488P 0.0000.0000.0000.0000.000

表4　(續)

*P<0.05與假手術組比較#P<0.05與損傷組比較(q檢驗)

3討論

DAI可激活對環境敏感的小膠質細胞，小膠質細胞在中樞神經系統中不僅起支持和營養作用，還是中樞神經系統內興奮性氨基酸(excitatory amino acids,EAA)代謝的重要場所，激活后成“阿米巴”樣，分泌大量的細胞因子、炎癥趨化因子、類花生酸類、蛋白水解酶及補體，還可釋放大量的興奮性氨基酸。且損傷的軸索可釋放Aβ，通過Glu受體促進小膠質細胞分泌Glu。本研究模型利用Marmarou等的直線加速損傷原理，造成DAI模型大鼠，應用米諾環素抑制小膠質細胞的激活；米諾環素是一種半合成的親脂性四環素類衍生物[5]，可通過血-腦屏障。近年來的研究表明，米諾環素是一種有效且安全的神經保護劑[6-8]。Nikodemova 等[9]研究發現米諾環素具有抑制小膠質細胞、星形膠質細胞、巨噬細胞、淋巴細胞的增殖和活化的效應。目前尚沒有特異性調節小膠質細胞的有效藥物，因此米諾環素這種最為廣泛而又有效的小膠質細胞活性抑制劑[10]可闡明小膠質細胞在神經系統中的功能。

本研究結果顯示，米諾環素干預組與損傷組比較，在12、24、48和72 h時CD11b表達差異有統計學意義，24 h以后小膠質細胞激活幅度明顯減少，證實米諾環素可明顯抑制小膠質細胞的激活；同時與損傷組比較，米諾環素干預組大腦皮層在12 h后、腦干在24 h后Glu及Asp升高幅度明顯降低，含量均明顯低于損傷組，與小膠質細胞降低幅度一致，證實米諾環素可通過抑制小膠質細胞的激活作用降低腦組織中Glu及Asp的含量。

EAA包括Glu和Asp。Glu是中樞神經系統中含量最豐富的EAA，參與多種物質的代謝調節。中樞神經系統急性損傷后Glu的大量釋放是造成一系列級聯反應進而導致細胞死亡的主要原因[11]，這需要通過與其特異性受體的結合得以實現[12],目前對于Glu受體功能的認識仍不完全。Glu受體家族的成員較多，這些受體廣泛在各種神經元及膠質細胞中表達，既可以介導興奮性效應，也可以介導抑制性效應，并參與其他離子型受體的調節[13]。神經元去極化時，Glu以Ca2+依賴方式釋放到突觸間隙中，激活位于突觸后的Glu受體使其過度激活介導大量的Ca2+內流，Ca2+內流在N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA受體)介導的神經系統損傷中起了重要作用[14]。對于興奮性氨基酸介導的細胞死亡通路及其相互作用和NMDA受體激活后下游靶點研究的突破，可進一步明確DAI中小膠質細胞介導的興奮毒性在二次損傷中的作用。(本文圖見封二)

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(本文編輯：劉斯靜)