甘西鼠尾草ISSR—PCR反應體系的建立與優化

甘西鼠尾草ISSR-PCR反應體系的建立與優化

李文淵， 王津慧， 童 麗， 熱增才旦， 楊 芳， 索南鄧登

(青海大學醫學院藥學系，青海西寧 810001)

摘要采用單因素試驗和4因素3水平的正交試驗相結合的方法，建立和優化甘西鼠尾草穩定的ISSR-PCR反應體系。結果表明，甘西鼠尾草20 ul ISSR-PCR體系中各因素的最佳濃度：10×Buffer(Mg2+)2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。

關鍵詞甘西鼠尾草；ISSR-PCR；優化

中圖分類號S567.23+9

基金項目青海省科技廳項目(2011-N-F19);青海大學中青年科研

作者簡介李文淵(1983- )，女，青海西寧人，講師，碩士，從事中藏藥資源研究。

收稿日期2015-08-03

Establishment and Optimization ofSalviaprzewalskiiMaxim. ISSR-PCR Reaction System

LI Wen-yuan, WANG Jin-hui, TONG Li et al (Medical College of Qinghai University, Xining , Qinghai810001)

AbstractUsing the single factor test and the 4 factors and 3 level orthogonal test, the ISSR-PCR reaction system and amplification program for Salvia przewalskii Maxim were established. The study showed that the optimum concentration for each factor in 20 μl ISSR-PCR reaction system were 10×Buffer(Mg2+)2 μl, dNTPs 0.4 mmol/L, Tag enzyme 1.0 U, primer 0.3 μmol/L, DNA30ng.

Key wordsSalviaprzewalskiiMaxim; ISSR-PCR; Optimization

甘西鼠尾草(SalviaprzewalskiiMaxim.)又名高原丹參，是藏區常用的藏藥(藏文譯音：吉子恩保)，因其有效成分與中藥丹參相似，功能主治亦與丹參相同，在西南、西北地區甘西鼠尾草普遍作為臨床治療心血管疾病中藥丹參的替代品種[1]。

近年來ISSR技術已應用于植物遺傳分析的各個方面，如品種鑒定[2]、遺傳關系及遺傳多樣性分析[3-4]、遺傳連鎖圖譜的構建[5-7]等研究。為確保ISSR分析結果的可靠性和重復性，進行ISSR-PCR反應體系的建立與優化非常必要。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料。甘西鼠尾草材料，采自青海省及甘肅省8個不同的居群。

1.1.2主要試劑與儀器。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB))(國藥集團)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)Solarbio、β-巰基乙醇(AMRESCO)、EDTA(國藥集團)、SDS(國藥集團)、溴化乙錠(EB)Sigma、瓊脂糖(GENETECH)，其他試劑為國產分析純。Tag酶、dNTP(Mg+)、10×buffer(TaKaRa)、ISSR引物由上海生工公司合成。冷凍離心機(Eppendorf)、紫外可見分光光度計(上海精科)、 凝膠成像系統(Tanon)、電泳儀( 北京市六一儀器廠)、水浴鍋( 東方電工)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取。以甘西鼠尾草為材料，用改良CTAB法提取DNA。采用1.5%瓊脂糖電泳，EB染色，凝膠成像系統觀察并拍照，-20 ℃保存。

1.2.2ISSR反應體系的建立與優化。隨機抽取一樣品的DNA作為模板，ISSR-PCR擴增體系為：在20 μl中，內含20 ng模板DNA，1.0U Tag聚合酶，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，2 μl的10×Buffer(內含Mg+)。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，在引物退火溫度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

為了優化反應體系，針對DNA、dNTPs、TagDNA酶和引物用量等，設置了一系列的濃度梯度，進行單因素試驗(表1)，為進一步優化反應體系，進行正交試驗L9(34)(表2)。

表1　ISSR-PCR反應體系的因素水平

表2　ISSR-PCR正交試驗設計 L 9(3 4)

2結果與分析

2.1模板DNA用量對ISSR-PCR擴增結果的影響由圖1可知，在20 μl反應體系中，模板DNA濃度在10～50 ng均能擴增出條帶，由此可知，DNA模板濃度對擴增結果影響較小，根據條帶的模糊和缺失與否，最終選用30 ng作為適宜的模板濃度。

注：M.DL2000；1～5.模板DNA濃度分別為10、20、30、40、50 ng。 圖1　不同模板DNA濃度對ISSR-PCR的影響

2.2dNTPs用量對ISSR-PCR擴增結果的影響由圖2可知，在20 μl反應體系中，dNTPs濃度為0.4 mmol/L時，條帶最為清晰，因此選用0.4 mmoI/L作為適宜的dNTPs濃度。

注：M.DL2000；1～5.dNTPs濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L。 圖2　不同dNTPs濃度對ISSR-PCR的影響

2.3引物濃度對ISSR擴增結果的影響由圖3可知，引物濃度在0.2～0.5 μmol/L時，擴增效率高，譜帶比較全面。綜合考慮，最終選用0.4 μmol/L為適宜的引物濃度。

注：M.DL2000；1～5.引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L。 圖3　引物濃度對1SSR-PCR的影響

2.4TagDNA聚合酶劑量對ISSR-PCR擴增結果的影響由圖4可知，TagDNA酶用量在0.75～1.25 U時均可以得到重復清晰的條帶，且無特異性擴增。從經濟適用的角度考慮，確定1.0 U/20 μl為適宜TagDNA聚合酶濃度。

2.5甘西鼠尾草ISSR-PCR反應體系正交試驗結果由圖5可知，在9個處理中，第4號處理擴增效果最好，譜帶強，多態性高。因此甘西鼠尾草最佳ISSR擴增反應條件為：反應體系10×Buffer 2 μl，DNA模板為30 ng，Primer為0.3 μmol/L，TagDNA聚合酶為1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L,無菌雙蒸水補足20 μl。

注：M.DL2000；1～5.TagDNA濃度分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 U。 圖4　TagDNA酶對1SSR-PCR的影響

注：M.DL2000。 圖5　正交設計1SSR-PCR反應體系的擴增

3討論

ISSR-PCR反應體系的影響因素較多，該試驗在前期進行了大量的預試驗工作，因此在反應條件的摸索上較為順利，最終確定適用于甘西鼠尾草20 μl ISSR-PCR體系中各因素的最佳濃度：10×Buffer(Mg2+)2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。此外，在試驗過程中發現，對同一樣品使用不同廠家的Tag酶，PCR擴增效果會有較明顯的區別。DNA模板的質量也直接影響試驗結果，在試驗前應充分保證DNA模板的純度。

參考文獻

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