腐植酸在褐鱒魚鰓和肌肉抵抗鎘中毒的組織病理學和生物化學作用

腐植酸在褐鱒魚鰓和肌肉抵抗鎘中毒的組織病理學和生物化學作用

Key words: toxicity; antioxidant enzyme; brown trout; histopathology; humic acid

鎘是一種有潛在毒性的重金屬元素，從上世紀起，它在大氣、水、土壤和植物中的濃度呈升高趨勢。由食物或水進入水生動物后，鎘與血液中的白蛋白和紅細胞結合而進一步轉移到組織和器官中。通過誘導金屬硫蛋白mRNA的合成，形成小分子量的金屬硫蛋白。鎘在生物體中的富集是一個值得關注的重要的生態學問題，尤其因為其快速積累的能力。對魚類而言，鎘能造成其各器官結構和病理形態學的變化。在魚類的腎臟和肝臟中含鎘量最高。近年來，特定酶系統和不同藥物，金屬離子和化學藥品之間的互作都有廣泛的研究。許多環境污染物會引起水生動物的氧化應激反應。化學有毒污染物是生物系統活性氧的重要來源，會抑制抗氧化防御系統中一些酶的活性。在環境毒理學和生態毒理學領域已經初步形成了氧化應激反應和對基礎生物分子的傷害以及器官的抗氧化防御系統。抗氧化酶如內源谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱苷肽S-轉移酶（GST）和過氧化氫酶（CAT）能降低造成組織傷害的活性氧含量。

腐植酸在環境中普遍存在，并發現它可以影響水生生物的生理功能。在歐洲獸醫實踐中，腐植酸已被用作止瀉劑，鎮痛劑，免疫刺激劑，抗菌劑。有文獻表明，在不同動物物種中，通過一些生理變化和免疫的形成，腐植酸與生長和健康防護能力有很大關聯。

本研究目的是為了調查腐植酸在褐鱒抵御鎘傷害過程中可能起到的保護作用。依據組織病理學毒性評估，對肌肉和魚鰓組織中抗氧化物GPx、SOD和MDA水平進行測定。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

褐鱒（Salmo trutta fario, L.），從阿塔特克大學漁業和內河魚類育種研究中心購買。該研究在魚毒理學實驗室進行，并在遵守批準的道德準則前提下開展。為了讓受試褐鱒適應環境條件，在實驗前，將其在池塘內預喂養15天。過了適應期后，10條褐鱒被放入400 lt（1 lt=1016 kg）體積的玻璃水箱中。用來測試的褐鱒平均重量為203.31±8.09 g，身長為22.21±0.49 cm。水箱水的理化性質為：溫度（10～12 ℃）；pH（7.4～8.0）；溶氧量（7.52±0.50 ppm）；水硬度CaCO3含量（164.1±4.17 ppm）。

腐植酸購于Farmavet醫學公司。配制一定濃度氯化鎘（Sigma）和腐植酸原液。原液中鎘和腐植酸的濃度分別為2 ppm，5 ppm。

待測褐鱒被分為4組。第1組為對照組，第2組為鎘處理組，第3組為腐植酸處理組，第4組為鎘+腐植酸處理組，每組有10條。給第2組褐鱒單次施入濃度2 ppm的氯化鎘。這個劑量為前人研究中對虹鱒造成毒性的劑量值。第3組褐鱒的單次施入濃度5 ppm的腐植酸。第4組褐鱒施入濃度2 ppm鎘和5 ppm腐植酸的混合液。褐鱒在含不同劑量鎘或（和）腐植酸的環境中生存7天。

1.2 生化分析

根據Alak等的方法，分析出褐鱒不同組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GPx），超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的水平。在Wiegand等的方法上進行改良，獲得每個個體各個組織的提取物。將組織浸入液氮，用研缽研磨。研磨后放入KH2PO4（30 mM，pH=7.3）緩沖液中混成勻漿。勻漿在4 ℃下，13000 rpm離心2 h后取上清液測定酶活性，用蛋白含量表示。褐鱒魚組織中MDA含量按照Gülcin等的方法測定。將200 μL溶血產物，800 μL磷酸鹽緩沖液（50 mM，pH=7.4），25 μL BHT和500 μL濃度30%的TCA，迅速混勻，在-20 ℃條件下放置2 h，然后以2000 rpm離心15 min，取1.0 mL上清液，分別加入75 μL EDTA-Na2H2O，250 μL TBA，之后放入沸水浴15 min，冷卻至室溫，在532 nm波長下測定。用總硫代巴比妥酸反應物來表示MDA的含量。每份勻漿的蛋白含量用Bradford（考馬斯亮藍G-250）法，以牛血清白蛋白為標樣，以MDA的摩爾消光系數1.56×105/（cm·M）計算得出。

1.3 組織病理學檢測

用于光學顯微鏡檢測的組織樣本先在10%的福爾馬林中固定24 h，在不同濃度的酒精下脫水后用二甲苯清洗干凈，將樣本埋入融化的石蠟中，之后用薄片切片機（Leica，Germany）切蠟塊切面。每個蠟塊連續切成5 μm厚的薄片。將切好的石蠟薄片在蘇木精-伊紅（H-E）中染色，然后在光學顯微鏡下觀察（Olympus BX52 with DP72 camera system）。所有組織病理學改變用圖像處理系統（Olympus，DP2-BSW）進行評估。光學顯微鏡檢測結果用半定量的方法進行評估，記錄如下：無病變（-），輕度病變（+），中度病變（++），重度病變（+++）。

1.4 統計分析

所有數據用平均值±標準偏差表示。用單因素方差分析法（ANOVA）和Duncan檢驗對數據進行分析。P＜0.05的數據被視作差異顯著。數據使用SPSS 10.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進行分析。

2 試驗結果

2.1 生化結果

與對照組相比，鎘的施加使褐鱒肌肉和魚鰓組織中SOD和GPx的水平顯著降低（P＜0.05），見表1、表2。施加腐植酸和鎘并沒有使褐鱒肌肉和魚鰓組織中SOD和GPx的水平顯著升高。鎘處理后，褐鱒肌肉和魚鰓組織中MDA數據并未顯著增加（P＞0.05）。同時也發現，與對照組數值相比，褐鱒鰓組織中MDA活性并沒有顯著富集。

表1 施加腐植酸(HA)對含鎘和不含鎘肌肉組織中GPx、SOD活性和MDA水平的影響Tab.1 The effects on GPx, SOD activity and MDA levels in the muscle tissue of humic acid (HA) administration to fishes with or without cadmium (Cd)

表2 施加腐植酸(HA)對含鎘和不含鎘魚鰓組織中GPx、SOD活性和MDA水平的影響Tab.2 The effects on GPx, SOD activity and MDA levels in the gill tissue of humic acid (HA) administration to fishes with or without cadmium (Cd)

2.2 組織病理學結果

對照組中的肌肉（圖1a）和魚鰓組織（圖2a）沒有任何病理學的變化；腐植酸處理組（圖1b和圖2b）同樣也沒有發現病理性變化；在鎘處理組發現有明顯變化。

在鎘處理組中，發現魚鰓組織的水樣變質，空泡性惡化，第二層腮瓣上皮細胞增生和第二層腮瓣的破壞（圖1c）。另外，在鎘處理組的肌肉組織中，發現組織間隙有單核細胞浸潤（圖2c）。同時施加鎘和腐植酸處理組也發現有類似的病理學變化；在該處理組的魚鰓組織中，血管堵塞，細胞衰退，脫皮（圖1d）；然而在該處理組的肌肉組織中發現有輕微炎細胞浸潤（圖2d）。病理變化的嚴重程度見表3。

圖1 不同處理魚鰓組織學表現Fig.1 Histologic appearance of gill tissue in different groups

圖2 不同處理肌肉組織學表現Fig.2 Histologic appearance of muscle tissue in different groups

表3 魚鰓和肌肉組織中病理學變化的嚴重程度Tab.3 The intensity and severity of histopathological alterations in gill and muscles tissues

3 討論

本研究旨在探究鎘對褐鱒的毒性效應和利用腐植酸防止毒性的可能性。病理學研究將金屬毒性歸咎于自由基和活性氧。生物體暴露在含鎘環境下，自由基的生成量和抗氧化防御系統都會有變化。在水生生態系統存在污染物，包括鎘，會使細胞內形成大量活性氧，對生物造成氧化性傷害。從而鎘會和一些基礎金屬競爭蛋白結合位點，引發Fe2+和Cu2+釋放，致使活性氧生成增加。

抗氧化酶水平是研究像重金屬類污染物影響的重要指標。抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶預防氧化應激反應。本研究中，鎘處理組中褐鱒肌肉和鰓組織GPx和SOD顯著下降，表明GPx和SOD抑制肌肉和魚鰓組織中氧自由基形成。相似報道稱，褐鱒受重金屬毒害時SOD和GSH-Px水平降低，造成組織自由基和氧化損傷。也有報道稱鎘破壞線粒體酶造成細胞和組織的缺陷。一般而言，金屬引起的氧化脅迫可直接通過氧化還原反應循環引起，也可間接通過干擾酶或非酶氧化脅迫抵御系統產生。因此，我們評估了一種膜脂過氧化產物MDA的功效。它可以作為檢測因金屬導致的早期細胞損傷氧化毒性的生物標記。結果表明，鎘及鎘+腐植酸處理組肌肉和魚鰓組織中MDA水平無變化。鎘+腐植酸處理組肌肉和魚鰓組織中GPx和SOD水平無顯著升高。

有報道稱腐植酸增強了鎘造成的急性和慢性毒性，不影響金屬在生物體內的富集。但也有研究表明，腐植酸持續降低鎘在各組織器官中的富集。通過水傳播，鎘可以在水生動物的全身，肌肉和脊椎中明顯富集。在Liu等的研究中，肌肉組織中的鎘含量高得令人擔憂。本研究中鎘+腐植酸處理組病理學變化相對較小，此結果表明，腐植酸降低了肌肉組織中的鎘毒性。

重金屬損傷是很多病理和毒物學過程中的一個重要因素。對魚類而言，鎘會造成多種器官結構和病理性變化。魚鰓是一重要組織，因其與水直接接觸，任何有直接或間接影響的物質都先通過鰓才能進入魚體內。有報道稱薄層上皮黏膜對水中溶解鉛反應，造成組織滲透調節不平衡。也有研究顯示，魚鰓擔當著鎘的儲藏庫。有報道稱，鎘脅迫會造成羅非魚（Oreo-chromis mossambicus）形態和生化指標的變化。魚類在有毒物環境極度活躍可能是由于其鰓因刺激而受到損害引發缺氧造成的。而血紅蛋白的增加可以補償受損的呼吸效率，這在降低歐鰱（Leucis-cus cephalus）鎘中毒試驗中有相似報道。本研究結果與之相似。因此，可以說明這該病理學變化是由鎘中毒造成的。

總之，病理學變化的加劇和抗氧化物活性的降低說明鎘處理對魚鰓和肌肉組織造成了傷害。腐植酸對鎘造成的傷害并沒有很多影響，但它可以減弱鎘引起的肌肉組織病理學變化。因此，腐植酸可調節肌肉組織中鎘毒性。

致謝和參考文獻(略)

譯自：Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，2013，（13）：315～320。

Gonca Alak1，Muhammed Atamanalp2，Ahmet Topal2，Harun Arslan2，Ertan Oru?3，Serdar Altun3著李 雙4譯
（1 土耳其阿塔特克大學農學系 埃爾祖魯姆 25240
2 土耳其阿塔特克大學漁業系 埃爾祖魯姆 25240
3 土耳其阿塔特克大學獸醫系 埃爾祖魯姆 25240
4 中國腐植酸工業協會 北京 100120）

為了探究腐植酸(HA)對褐鱒魚鰓和肌肉在抵抗鎘(Cd)中毒方面是否發揮積極作用，進行了組織病理學和生物化學方面的研究。試驗中，褐鱒暴露在僅施加2 ppm鎘，施加2 ppm鎘加5 ppm腐植酸，僅施加5 ppm腐植酸的3種環境條件下，分別測定其鰓和肌肉組織的谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平。在含鎘條件下，褐鱒組織中的GPx和SOD活性顯著低于對照組(P＜0.05)，而含鎘環境中褐鱒組織的MDA并未升高(P＞0.05)。然而，腐植酸并未影響鎘造成的生化傷害。鎘對魚鰓和肌肉組織造成明顯的組織病理學變化，而在鎘+腐植酸處理組中，肌肉組織病理學變化較小。這些結果表明，腐植酸可從組織病理學方面中和肌肉組織鎘中毒。

毒性 抗氧化酶 褐鱒 組織病理學 腐植酸

Histopathological and Biochemical Effects of Humic Acid Against Cadmium Toxicity in Brown Trout Gills and Muscles

Gonca Alak1, Muhammed Atamanalp2, Ahmet Topal2, Harun Arslan2, Ertan Oru?3, Serdar Altun3write Li Shuang4translate

(1 Turkey Ataturk University, Agriculture Faculty, Erzurum, 25240
2 Turkey Ataturk University, Fisheries Faculty, Erzurum, 25240
3 Turkey Ataturk University, Veterinary Faculty, Erzurum, 25240
4 China Humic Acid Industry Association, Beijing, 100120)

It was biochemically and histopathologically investigated whether humic acid (HA) has protective effects on cadmium (Cd) toxicity on muscle and gills of brown trout. The brown trout were exposed to cadmium (2 ppm) and/or humic acid (5 ppm). For this purpose, levels of glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) was investigated in muscle and gills tissues of brown trout. The activities of GPx and SOD in the tissues of fish exposed to Cd was significantly lower than the control groups (P<0.05). MDA levels did not increase in the groups exposed to cadmium (P>0.05). Hovewer, humic acid did not affect biochemical damage in cadmium group. Cd caused a significant increase in histopathological changes in muscle and gills tissues, but histopathological changes were lower in the muscle tissue of Cd+HA group. These results suggest that humic acid may counteract the cadmium toxicity in muscles tissue in histopathologic aspect.

TQ314.1

A

1671-9212(2015)06-0029-05

2013-09-09

李雙，女，1983年生，博士，主要從事園林植物遺傳育種研究，E-mail：chaia@126.com。