恩施黑豬血液指標測定分析及和CXCR4基因多態性的關聯分析

向 宇，李宗明，李佳萍，劉國平，李長春，李新云，趙書紅

（1.華中農業大學 農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025）

恩施黑豬血液指標測定分析及和CXCR4基因多態性的關聯分析

向 宇1，李宗明2，李佳萍1，劉國平2，李長春1，李新云1，趙書紅1

（1.華中農業大學 農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025）

為了解探究恩施黑豬這一地方豬種的免疫特性，采集了湖北某豬場的218頭免疫系統成熟的純種恩施黑豬，測定了24項血液五分類指標并與農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室對其他中外豬種的血液參數值進行了分析比較；對免疫候選基因CXCR4進行了多態性分析并發現SNP位點g542.C＞T和部分血液指標顯著關聯，為恩施黑豬的抗病育種提供了潛在的分子標記。

恩施黑豬；血液指標；CXCR4；關聯分析；分子標記

恩施黑豬是原產自湖北省西南部恩施自治州的地方優良豬種，具有良好的抗逆性和抗病力。目前對于恩施黑豬這一地方豬種的血液指標研究不多，大部分集中在對其生產性能和胴體品質等方面的開發利用，尚未見對其免疫候選基因分子標記的發掘。本試驗希望通過對黑豬血液指標的測定和分析，結合免疫候選基因SNP位點的篩選，為恩施黑豬的選育提供支持。

1??材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗材料樣品來自于湖北省某豬場的218頭純種恩施黑豬，按照統一標準進行飼養，日齡在五月齡以上，免疫系統均已成熟且健康狀況良好，執行統一的免疫程序，健康狀況良好。

1.2 血液采集和血液指標的測定

用繩套或保定器套住恩施黑豬上頜部，自然保定，將一次性靜脈采血針穿刺針頭插入黑豬耳靜脈，通過透明硅膠軟管將另一頭接入帶抗凝劑EDTANa2的真空負壓抗凝管中，待血液至5 mL刻度處拔出穿刺針頭，待軟管內血液流入負壓管內拔出管塞穿刺針頭，輕微顛倒試管以便血液和抗凝劑重復混勻，放置于4 ℃短暫保存。

4 h內將血樣用BC-5800全自動血液分析儀進行血液五分類檢測，上機檢測前需再次搖勻。采血時間統一在涼爽的早晨豬只尚未進食之前，便于減少豬只應激和保持血液指標的穩定。

血液五分類檢測的數據包括24項參數指標：白細胞數(WBC)、紅細胞數(RBC)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞分布寬度標準差（RDW-SD）、紅細胞分布寬度變異系數(RDW-CV)、血紅蛋白(HGB)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、大型血小板比率(P-LCR)、中性細胞比率(NEUT%)、淋巴細胞比率(LYMPH%)、單核細胞比率(MONO%)、嗜酸性粒細胞比率(EO%)、嗜堿性粒細胞比率(BASO%)、中性細胞數(NEUT#)、淋巴細胞數(LYMPH#)、單核細胞數(MONO#)、嗜酸性細胞數(EO#)、嗜堿性細胞數(BASO#)。

1.3 數據分析比較

應用SPSS 17.0統計軟件分析所有血液指標，計算血液指標的平均值、中值、標準差，與中國其他地方豬種及外來引進豬種的相同血液指標進行分析比較。其他中外豬種的血液指標來自文獻報道：杜洛克、大白豬、二花臉[1]、通城豬[2]。

1.4 DNA提取，CXCR4基因擴增和表型關聯分析

保定恩施黑豬，讀取耳號或耳牌記錄個體信息，用耳號鉗夾取恩施黑豬耳組織，剪下的耳組織樣用鑷子裝入2 mL EP管中，采用天根生化科技有限公司血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（離心柱型），按照說明書步驟提取。提取DNA后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和濃度測定。

根據已報導的文獻和本實驗室前期工作，用Primer 5設計了CXCR4基因外顯子區域的3對引物送上海生工公司合成，引物信息如表1所示。

PCR反應體系為總體系10 μL，包括PCR Mix 5 μL，正向引物和反向引物各0.3 μL，DNA模板1 μL（50 ng/μL），ddH2O 3.4 μL。

PCR反應過程為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度（52～57 ℃）40 s，72 ℃延伸40 s，重復35個循環，最后72 ℃5 min，低溫4 ℃保存。

2??結果

2.1 恩施黑豬血液五分類指標測定結果

恩施黑豬血液五分類指標測定結果如表2所示。之前相關文獻統計的地方豬種的血液五分類指標，白細胞數（WBC）參考范圍為10.73～33.13，紅細胞（RBC）參考范圍為5.15～8.12，血紅蛋白（HGB）參考范圍為96.03～177.52，血小板（PLT）參考范圍為172.61～443.88[3-5]。本次五分類測定的平均結果基本處于參考范圍之內，但部分極值超出了參考范圍。

2.2 恩施黑豬血液指標相關分析結果

對恩施黑豬血液指標進行相關分析，結果如圖1所示。白細胞五分類中每類型的細胞即淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞的數目與自身細胞比率存在極顯著的正相關（P＜0.01），且相關系數分別為0.691，0.839，0.903，0.769和0.929。白細胞數目和淋巴細胞比率、嗜酸性粒細胞比率、嗜堿性粒細胞比率、紅細胞數、血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞平均體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白量濃度均存在顯著的負相關（P＜0.05），而和中性粒細胞比率、中性粒細胞數、淋巴細胞數、單核細胞數存在顯著的正相關（P＜0.05）。淋巴細胞比率和中性粒細胞比率存在顯著的負相關（P＜0.05），相關系數為-0.7，中性粒細胞比率和其他幾種白細胞比率同樣存在顯著的負相關（P＜0.05）。此外紅細胞和血紅蛋白、紅細胞壓積間存在顯著的正相關（P＜0.05），血紅蛋白與紅細胞壓積間也存在顯著的正相關（P＜0.05）；平均血紅蛋白量和紅細胞平均體積間同樣存在顯著的正相關（P＜0.05），平均血小板體積和大型血小板比率間存在極顯著的正相關（P＜0.01）血小板分布寬度與血小板及血小板壓積存在顯著的負相關（P＜0.05）。

表1 候選基因CXCR4引物信息

表2 恩施黑豬血液免疫指標總體統計

圖1 血液指標間的相關系數

2.3 恩施黑豬和其他豬種血液指標比較結果

將恩施黑豬和其他中外豬種相同的血液指標進行方差分析，結果恩施黑豬在WBC、RBC、HCT、MCV、HGB、LYMPH%、LYMPH#指標上均顯著高于大白豬群體和杜洛克群體，在MCH、MCHC、PLT、PCT指標上顯著高于二花臉群體。在紅細胞和白細胞數目上與通城豬無顯著差異。

2.4 CXCR4基因SNP位點和血液指標關聯結果

采集恩施黑豬耳樣提取DNA，隨機選取10個恩施黑豬基因組DNA混合成的DNA pool，根據設計的引物進行PCR擴增。將擴增PCR原液送公司測序，使用Seqman對峰圖進行分析，結果發現 CXCR4基因第2外顯子上發現一個g.542 C＞T的SNP位點。通過直接測序法進行基因分型，將該位點分型結果和血液指標進行關聯分析，結果如表所示。該位點和WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT顯 著 關 聯（P＜0.05）。 其 中CC基因型個體的WBC、NEUT%、NEUT#、PCT均值顯著高于其他型個體（P＜0.05），TC基因型個體的LYMPH%、LYMPH#、PLT、PCT均值顯著高于其他型個體（P＜0.05），MONO%、HGB均值顯著低于其他型個體。

表3 CXCR4基因SNPg.542C＞T與表型性狀的關聯

3??討論

血液指標特別是五分類指標能有效反映機體的免疫狀態，從生理角度來說，血紅蛋白本身是紅細胞中的唯一非膜蛋白，由尚未成熟的紅細胞核糖體產生，兩者在數量上呈現顯著相關性；本次五分類測定中，這兩者的均值處在參考范圍里的較高，白細胞和中性細胞數、中性細胞比率呈顯著正相關(P＜0.05)，可能是骨髓干細胞分化的白細胞中，中性粒細胞壽命最短，骨髓造血能力大部分用于中性粒細胞的供給，機體正常水平時中性粒細胞和白細胞數目變化趨勢呈現一致的一種體現[4]。和免疫功能有關的大部分細胞如淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞和嗜堿性粒細胞均存在不同程度的相關，表示機體的免疫系統是一個相互作用復雜的整體。在臨床上部分血液指標的急劇升高或降低可以作為產生疾病的征兆，但仍需要具體的抗原檢測。總之，了解血液指標的正常范圍波動和不同指標間的相關性有利于我們把握畜群的健康狀態。

在中外豬種的血液指標比較中發現，恩施黑豬與杜洛克、大白豬這類引入品種在多項指標上均存在顯著差異，而與二花臉、通城豬這類中國地方豬種在紅細胞、白細胞數目上無顯著差異；這充分表明了中國地方豬種和國外引入品種在免疫性狀上的差異同樣體現在不同類型的血細胞數目上。之前有研究表明，中外豬種的免疫細胞數目存在顯著性差異，例如梅山豬和大白豬的單核細胞及中性粒細胞[5]。而中國地方豬種內部血液指標的差異則主要集中在血紅蛋白和紅細胞分布上，這可能與不同地方豬種分布的不同區域和環境有關，同時也要考慮個體和品種之間的差異對不同血液指標的影響。

通過候選基因法發現了CXCR4基因第二外顯子上發現一個g.542 C＞T的SNP位點與WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT顯著關聯（P＜0.05）。CXCR4基因是趨化因子受體家族成員之一，趨化因子受體4又被稱為融合素、CD184。CXCR4的天然配體是基質細胞衍生因子CXCR12，兩者相互作用形成的CXCR4/SDF-1生物學軸在參與細胞遷移、胚胎發育、腫瘤轉移與增殖、免疫調節炎癥反應、細胞凋亡等眾多生理病理過程都有著重要的意義[6]。已有研究也證實在CXCR4基因缺失的小鼠體內B細胞前體細胞減少，而在血液中卻明顯增加。骨髓內顆粒細胞也減少，但在血液中未成熟顆粒細胞明顯增加[7]。同樣有研究表示，CXCR4基因的不同SNP單倍型和HIV病毒、霍金奇淋巴癌、白血病感染等血液疾病和腫瘤感染有顯著相關，而且影響了感染后的白細胞數目變化及白細胞遷移情況。

因此，發現的CXCR4基因該SNP位點可能用于探究血液指標變化，作為恩施黑豬免疫候選分子標記應用于該品種的選育。

[1] 劉向東，樊斌，趙云霞，向安靜，朱猛進，彭中鎮，趙書紅. 中國地方豬二花臉與國外品種仔豬血液參數差異比較分析.[J] 中國豬業，2013，S1：202-203.

[2] 劉榜，張慶德，李奎，樊斌，官紅平，彭中鎮，徐三平，杜亞球. 通城、瑞典長白、英國大白及其三元雜種豬部分免疫性狀研究. [J] 畜牧獸醫學報，2005，07： 35-38.

[3] 趙拴平，王睿琪，唐中林，昝林森，李奎. 3個地方品種豬血液生化指標分析. [J]中國畜牧獸醫，2012，39，2：96-99.

[4] 金伯泉. 細胞和分子免疫學[M]. 第2版.北京：科學出版社，2001.

[5] Clapperton M，Bishop SC，Glass EJ. Innate immune traits differ between Meishan and Large White pigs.[J] Veterinary immunology and immuno pathology.2005，104：131-144

[6] Kawabata K， Ujikawa M， Egawa T，et al.A cell-autonomous requirement for CXCR4 in long-term lymphoid and myeloid reconstitution.[J] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1999，96：5663-5667.

[7] 王宜青. SDF-1/CXCR4軸以及MCP-1/CCR2軸對小鼠骨髓間充質干細胞遷移及歸巢的影響[D]. 蘇州大學， 2014.

2015-06-23）

湖北省重大科技創新計劃產業化項目（2014ABC012）、湖北省杰出青年基金（2014CFA024）和教育部科技學技術項目（113048A）