內窺鏡法豬克隆胚胎移植研究

竇紅偉，鄭 華，田家寧，夏代剛，蒙小云，李 勇，石 偉

（1. 深圳市農牧實業有限公司，廣東 深圳 518023；2. 深圳華大方舟生物技術有限公司，廣東 深圳 518083）

內窺鏡法豬克隆胚胎移植研究

竇紅偉2，鄭 華1*，田家寧2，夏代剛1，蒙小云1，李 勇2，石 偉1

（1. 深圳市農牧實業有限公司，廣東 深圳 518023；2. 深圳華大方舟生物技術有限公司，廣東 深圳 518083）

傳統的手術法開展豬克隆胚胎移植會使受體母豬的創傷比較大，術后恢復慢和容易傷口感染等會影響克隆胚胎著床，從而影響移植成功率；同時，受體利用率低。為摸索新的豬克隆胚胎移植方法，和提高受體在胚胎移植中的利用次數，降低受體手術應激，應用內窺鏡開展了20頭豬克隆胚胎移植試驗，結果分娩1頭（4頭活仔），移植成功率僅為5%。研究表明，內窺鏡法開展豬克隆胚胎移植是可行的，但還需要繼續摸索總結，才能提升移植成功率，熟練和標準化操作是內窺鏡移植能否成功的關鍵。

克隆；豬胚胎移植；內窺鏡

目前豬克隆胚胎移植的主流方法是手術法[1]。傳統的手術法開展豬克隆胚胎移植會使受體母豬的創傷比較大，術后恢復慢，容易傷口感染，從而影響克隆胚胎著床和移植成功率。借鑒克隆羊技術[2]，內窺鏡法進行豬克隆的胚胎移植是值得嘗試的。內窺鏡法屬于微創手術，切口很小，只需在腹部切開1 cm左右的2～3個小口，將腹腔鏡插入腹腔，在腹腔鏡引導下，將胚胎植入子宮。這種方法雖然仍需要麻醉和類似于常規手術的程序，但由于手術切口小，切口恢復快，術后反應輕，出血腫脹時間可大大減少，不但降低了手術的感染概率，對受體母豬損傷和應激亦小得多，故可增加手術的精確性及安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腹腔內窺鏡、顯示器、氣腹機、冷光源、CO2氣體、受體母豬、培育好的克隆胚胎數枚、無菌操作實驗室、手術臺、手術麻醉劑、氧氣、笑氣及呼吸麻醉機系統一套、手術刀、縫合針線等。要求試驗母豬單獨飼養，術前徹底清潔消毒；移植的胚胎要求發育良好，嚴格按照恒溫38.5 ℃條件保存；手術前對手術室進行24 h紫外線照射處理；對參與手術的人員手術前做好消毒凈化工作；手術所用的刀具、耗材做好消毒無菌工作，確保胚胎移植過程處于無菌操作。

1.2 試驗方法

1.2.1 供體細胞建系及選擇

1.2.1.1 供體的選擇

在本試驗開始前，根據我公司種豬群育種數據選擇遺傳指數高的，生產性能好的公豬作為此次試驗的供體。

1.2.1.2 組織樣品采集

保定好供體，采樣人員對供體耳緣周邊進行消毒清理，剃掉皮膚上層的絨毛，用采樣器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉，裝入樣品管，放入專用冷凍箱低溫（4 ℃)保存，運回實驗室進行細胞建系。

1.2.1.3 細胞建系

將采好的耳緣組織樣品送至深圳華大方舟生物技術有限公司進行細胞建系，并傳代培養和超低溫液氮凍存。

1.2.1.4 克隆胚胎構建

將所建細胞系傳至P5～P6，利用手工克隆技術進行克隆胚胎的構建，并且體外培養至第6天，發育至囊胚。用于移植的胚胎，挑選原則是盡量選取形態良好、擴張充分、內細胞團明顯的囊胚。

1.2.2 胚胎受體的選擇

胚胎受體的選擇標準：分娩過程長短正常、異常仔豬少、產后恢復快、未有子宮炎癥狀及奶水好的母豬，同時選擇斷奶發情要在7 d以內的母豬，而且發情表現要很明顯，本試驗由于研究經費的限制和減小對試驗場生產沖擊，對受體母豬的選擇沒有嚴格執行這些標準，而是選取了一些斷奶較長時間發情、空懷、返情和后備母豬。

1.2.3 移植時間

1.2.3.1 受體斷奶時間

在確定了手術移植時間后，反推母豬斷奶時間，即手術時間反推5 d為發情日期，發情日期反推6 d為斷奶日期。

1.2.3.2 移植胚胎的胚齡

經過手工克隆重構胚，為發育至6 d的囊胚。

1.2.4 手術前的準備工作

1.2.4.1 移植胚胎的準備

用專門的撿胚器對擬移植的胚胎進行分撿并裝入麥管，每頭受體母豬準備2個麥管，每個麥管大約裝入30枚胚胎。將裝好胚胎的麥管放入恒溫的運輸箱。

1.2.4.2 受體母豬

發情后對受體母豬實行單欄飼養，術前做好清洗及消毒工作，手術前12 h禁食。

1.2.4.3 手術儀器準備和檢查

準備手術器械、高壓蒸汽鍋、手術服、外科手術手套、口罩、縫線、洞巾、磺胺、生理鹽水、碘酊、酒精、酒精棉、紙巾、消毒紗布。對所有進入手術室的器材都要進行滅菌處理。首先確定手術需要幾套滅菌器材，滅菌前用洗潔精清洗器材并用蒸餾水洗凈，然后通過高壓蒸汽鍋進行高壓高溫滅菌；高壓蒸汽鍋在103.4 kPa（1.05 kg/cm2）蒸汽壓下，溫度達到121.3 ℃，維持15～20 min，即可達到滅菌的效果；已滅菌的物品做好標記，與未滅菌的物品分開保存，以免弄錯。

1.2.5 豬克隆胚胎的移植手術

1.2.5.1 操作準備與消毒

1）把受體母豬趕到緩沖間，用套嘴鋼絲繩保定，注射誘導麻醉劑復方獸用氯胺酮2 mL。

2）把受體豬抬到手術臺上，用加新潔爾滅的清水清洗腹部，剃毛，擦干。

3）把受體豬套上呼吸面罩，打開氧氣流量計開關到0.8 L/min（浮子小球浮動到刻度線），接著將異氟烷開到最大5%，最后打開笑氣（N2O）流量計到0.5 L/min。

4）用75%酒精噴灑手術器械載臺，用消毒紙巾擦干。

5）手術人員戴口罩和帽子，穿手術服，最后戴手術手套，注意穿戴規則和順序，操作時切忌碰到手套的外面，防止污染。

6）用手術鑷夾持碘酊消毒手術部位(由內往外，成螺旋狀)，再噴灑75%酒精脫碘，然后用生理鹽水沖洗，酒精和生理鹽水的噴灑方法同碘酊消毒一樣，由內往外，不能來回重復。最后用消毒紗布拭干微創手術部位及外圍。

1.2.5.2 微創開刀

為了在受體母豬體內能夠準確找到子宮部位，需要開3個小創口。首先用手術刀在肚臍附近割一個2 cm的創口，插入氣腹針，手感穿過肌肉后的鏤空感，馬上停止，連上氣腹機軟管，慢慢加大腹壓，直到加到最大，觀察受體腹部變化，并叩打腹部，聽聲音并同時看氣腹機的讀數，如果進氣的話，讀數會不斷增加。當讀數達到4～5 L的時候，受體腹部會有明顯的鼓起。

1.2.5.3 引入內窺鏡

把光纖和光源連接起來，把內窺鏡連線和成像儀連接起來，當受體腹部有明顯鼓起時，拔下氣腹針，插入穿刺器，同時把氣腹機軟管連接穿刺器上，拔出套管內的穿刺針，插入連接成像儀和光源的內窺鏡，觀察腹腔內部情況。把內窺鏡鏡頭對準腹壁相應位置，插入另外2個穿刺器。

1.2.5.4 尋找輸胚位置

穿刺器插好后，拔出穿刺針，插入2把抓取鉗，內窺鏡與抓取鉗配合找到子宮角，并順著子宮角用2把鉗子交替夾持，找出卵巢，觀察卵巢的排卵情況，可以剝開輸卵管傘，觀察后再把卵巢用輸卵管傘包起來。找出宮管接合處，用抓取鉗夾持子宮角，調整好輸胚角度。

1.2.5.5 輸胚

調整到最佳位置后，放開另一把抓取鉗，并把16#鈍性打孔針經穿刺器套管伸入腹腔，在宮管結合部打孔，避免在可見血管稠密處進針，將裝有胚胎的注射針經該孔伸入子宮腔中，徐徐推入豬克隆胚胎。輸胚完成后用止血鉗夾持小孔一段時間，防止出血，另一側子宮同上操作。

1.2.5.6 縫合

輸胚結束后，放空腹腔內的氣體，確保放空后拔下穿刺器套管，傷口撒上磺胺后縫合1～2針，手術即結束。

1.2.6 術后管理及觀察

待受體母豬完全清醒后，單獨飼養管理，視傷口愈合情況決定是否需要相應治療。如恢復良好，按照配種后1個月母豬標準進行飼養管理，在28 d時通過B超進行查孕，確定受體是否懷孕。

2 結果與分析

表1 內窺鏡法豬克隆胚胎移植試驗結果

2013年5月15日至8月26日間，我們共開展了20頭母豬的內窺鏡法移植試驗。從移植效果來看，18頭受體母豬都返情。L12003504號母豬雖然沒有返情但剖腹產時發現無仔，也沒有死胎和木乃伊，應該是胚胎死亡后被吸收了。L9033714號母豬剖腹產4頭活仔。內窺鏡法胚胎移植20頭母豬成功1頭，分娩率達到5%（1頭/20頭），移植效果不甚理想。但既然有了1頭受體母豬分娩，說明內窺鏡法開展豬克隆胚胎移植是可行的，只是還需要繼續摸索總結，才能提升移植成功率。

3 討論

本研究嘗試內窺鏡法進行豬克隆胚胎移植，但移植成功率較低，究其原因在于受體母豬的選擇。

3.1 受體母豬的選擇

受體母豬因素對克隆豬生產效率的影響是顯著的[3]。我們利用腹腔內窺鏡開展克隆豬的胚胎移植，只是覺得原理上可行，抱著試試看的心態，為減少對豬場正常生產經營的影響，所以選取的受體母豬基本上都是繁殖異常母豬，其中有4頭為返情母豬，7頭為空懷母豬，1頭為后備母豬，只有8頭是斷奶母豬，且基本是推遲發情的母豬。由于這些受體母豬本身繁殖異常，即便按正常程序配種，其受胎率和分娩率也可能不高，所以造成克隆成功率低。

3.2 內窺鏡操作需要專業技能，熟練和規范操作是移植成功的關鍵

由于整個試驗過程都是在視野狹窄的內窺鏡下進行，操作難度大，力度、角度和位置沒有掌握好，或者熟練度不高都會影響試驗效果。譬如，內窺鏡剛插入腹腔時，與腹腔溫度有溫差，如果不對鏡頭進行預熱，會出現鏡頭結霧影響操作；插入另外2個穿刺器時，如果力量沒有把握好，不注意腹壁情況，會扎穿腹壁傷到內臟；卵巢和子宮角的查找，會延長手術時間和造成傷害；子宮角打孔會造成穿孔或刺入子宮壁，造成胚胎損失和移植失敗等等。熟能生巧，只有不斷嘗試和總結，提高操作技能，并不斷將操作標準化，才能真正地提高胚胎移植成功率。

[1] 李旭陽，邳明偉，孫慧敏，等.克隆豬的胚胎移植技術及其應用[J].豬業科學，2006， 23（2）：10-12.

[2] 王申元，周歡敏，張立，等.不同處理方法對綿羊克隆胚胎的移植比較研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2010（1）：51-52.

[3] 衛恒習，李秋艷，高鳳磊，等. 胚胎移植方法和受體母豬因素對克隆豬生產效率的影響[J]. 中國農業科學，2012，45(15)：3147-3153.

2014-11-13）

國家現代農業產業技術體系（編號：CARS-36）、深圳市科技計劃項目（編號：JSA200904011807A）