潛陽解毒通絡方對自發性高血壓大鼠心肌纖維化的影響

崔英子 郭家娟 李相軍 魏巖 宋晶

潛陽解毒通絡方對自發性高血壓大鼠心肌纖維化的影響

崔英子1郭家娟1李相軍2魏巖3宋晶3

目的 觀察潛陽解毒通絡方在自發性高血壓大鼠（SHR）心肌組織膠原合成和心肌纖維化中的作用。方法 12周齡雄性自發性高血壓大鼠（SHR）分為SHR應用潛陽解毒通絡方組（QYTL組）、SHR應用糜酶抑制劑組（Chy-I組）、SHR應用潛陽解毒通絡方及糜酶抑制劑組（QY＆ Chy-I組）、SHR組，另設10只12周齡的雄性W istar-Kyo to大鼠（W KY）為正常對照組。檢測各組大鼠的收縮壓、心肌膠原容積分數（CVF）、心肌血管周圍膠原面積比（PVCA）和心肌糜酶及I、III型膠原m RNA表達水平。結果 QYTL組、QY＆ Chy-I組和Chy-I組心臟CVF、PVCA 與SHR組比較顯著下降（P＜0.01），與W KY組比較無顯著差異。QYTL組、QY＆ Chy-I組和Chy-I組心肌組織I、III型膠原和糜酶m RNA表達相對含量均低于SHR組（P＜0.01），與W KY組比較無顯著性差異。QYTL組、QY＆ Chy-I組大鼠血壓與SHR比較有顯著改變，Chy-I組大鼠血壓與SHR比較無顯著改變。結論 心肌組織糜酶參與膠原的合成及細胞外基質的形成和降解，潛陽解毒通絡方可能通過抑制糜酶途徑改善心肌纖維化。

潛陽解毒通絡方；糜酶；自發性高血壓大鼠；心肌纖維化；膠原

高血壓左心室肥厚的發展伴有心肌細胞肥大和心肌間質纖維化。多項研究［1］證實，Chymase在心室肥厚、心肌纖維化、心衰的發生、發展中起重要作用。Chymase已成為心血管疾病的重要藥靶，從Chymase-AngⅡ途徑探討心室肥厚及其干預有著重要的理論與臨床意義。課題組依據任繼學教授提出的“毒傷血絡”學說基礎，以調整肝腎、化瘀通絡為原則組成“潛陽解毒通絡”方，臨床療效可靠。前期研究已證實AngII是潛陽解毒通絡方改善自發性高血壓大鼠（SHR）左室肥厚，逆轉心肌間質重構的重要靶點。本研究通過觀察潛陽解毒通絡方對心肌肥厚、心肌膠原合成和心肌纖維化相關指標的影響，探討潛陽解毒通絡方介導Chymase·AngⅡ途徑干預心室肥厚機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 12周齡雄性自發性高血壓大鼠（SHR）40只適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為潛陽解毒通絡治療組、糜酶抑制劑組、潛陽解毒通絡+糜酶抑制劑組、SHR空白對照組，每組各10只；另設10只12周齡的雄性Wistar-Kyoto大鼠（WKY）為正常對照組。均由北京維通利華公司提供。均予喂養普通飼料，并灌胃等量正常飲用水。

1.1.2 實驗藥物 （1）潛陽解毒通絡方（主要成分：夏枯草、牛膝、茺蔚子等）由吉林萬通醫藥有限公司生產，每克清膏含生藥10.625 g。（2）糜酶抑制劑SBTI（Soybean trypsin inhibitor），購于Sigma公司。

1.1.3 給藥 （1）潛陽解毒通絡治療組：給予灌胃潛陽解毒通絡方混懸液15 m l·kg-1·d-1，2次/天；（2）糜酶抑制劑組：給予糜酶抑制劑10mg/（kg·d）；（3）潛陽解毒通絡+糜酶抑制劑組：給予糜酶抑制劑10mg/（kg·d），給予灌胃潛陽解毒通絡方混懸液15m l·kg-1·d-1，2次/天；（4）SHR空白對照組：予等量生理鹽水灌胃；（5）WKY正常對照組：予等量生理鹽水灌胃。

1.2 標本采集及實驗方法

應用RBP-1B型大鼠尾壓測定儀，每周測收縮壓（SBP）一次。各組大鼠飼養8周后，戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉處死，冰上分離左心室，取中間段1/3左心室中性甲醛固定后石蠟包埋切片，其余組織液氮速凍，保存待用。采用改良Masson三色法顯示心肌間質纖維，利用計算機真彩色圖像分析儀測算心肌間質膠原容積分數（CVF）和心肌血管周圍膠原面積比（PVCA）。計算公式：CVF=膠原面/總面積，PVCA=壁內小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積。

1.3 心肌組織I、III型膠原和糜酶mRNA表達

采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法進行檢測。利用Primers軟件設計引物（表1），上海博亞生物技術有限公司合成。

擴增條件：94℃，變性5 min，然后再94℃變性1 min，退火30 s（見表1），72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸10 min。擴增長度見表1。PCR產物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統（UV Transilluminator）進行圖像分析并測其密度比值。

表1 心肌組織I、III型膠原和糜酶引物序列、長度和退火溫度

表2 各組動物血壓變化［n=9,（x-±s），mm Hg］

表3 各組動物CVF和PVCA的改變［n=9,（x-±s）］

表4 各組動物心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原和糜酶m RNA表達豐度的變化［n=9,（x-±s）］

1.4 統計分析

采用SPSS 10.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x-±s）表示，組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗、秩和檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠SBP水平變化

入組時SHR各組血壓均比WKY組顯著增高（P＜0.01），實驗第2、4、6、8周，QYTL組和QY＆Chy-I組SBP均有不同程度下降，與SHR組比較差異顯著（P＜0.01），Chy-I組血壓與SHR組SBP比較無顯著差異，見表2。

2.2 CVF和PVCA的改變

Masson染色顯示，SHR組的心肌細胞和小血管周圍膠原纖維環繞呈網格狀，血管周圍的膠原纖維延伸至心肌細胞間。QYTL組、QY＆ Chy-I組和Chy-I組膠原纖維明顯比SHR組減少，見表3。

2.3 心肌組織糜酶mRNA表達改變

QYTL組、QY＆ Chy-I組和Chy-I組心肌組織糜酶mRNA表達豐度比SHR組減少（P＜0.01），與WKY組比較無顯著差異，見表4。

2.4 心肌組織I、III型膠原mRNA表達的變化

QYTL組、QY＆ Chy-I組和Chy-I組心肌組織I、III型膠原mRNA表達豐度均比SHR組顯著減少（P＜0.01），與WKY組比較無顯著差異，見表4。

3 討論

原發性高血壓病（EH）為心血管系統常見病和多發病，其中心肌細胞肥厚和心肌間質纖維化是繼發于高血壓病的病理過程［2］，嚴重影響到心血管病人的生存率和生活質量。目前研究認為，腎素血管緊張素系統（RAS）在調節容量超負荷或壓力超負荷導致的心肌肥厚和心肌纖維化中起重要作用［3］；其中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是目前最強的促心肌肥厚因子［4-5］。

近年來的研究顯示，機體內存在著兩類AngⅡ生成途徑：血管緊張素轉換酶（angiotensin covertingenzyme，ACE）依賴的AngⅡ生成途徑（常規途徑）和非血管緊張素轉換酶依賴的AngⅡ生成途徑（其他途徑）。其他途徑包括糜酶、血管舒緩素，組織蛋白酶G等。其中糜酶途徑是最為重要的途徑，研究表明，人體心臟80％的AngⅡ，是通過糜酶（Chymase）產生，來源于心臟組織肥大細胞的糜酶在心臟重構過程中起重要作用，被證實與人體內的多種疾病過程有關，如動脈硬化、高脂血癥、動脈瘤等［4，6］。因此糜酶在心血管疾病中的病理生理作用越來越受到重視。本研究結果提示潛陽解毒通絡方可能通過抑制糜酶途徑發揮了抗心肌纖維化的作用。

由于糜酶抑制劑對血管緊張素I沒有影響，因此糜酶抑制劑對于SHR血壓未產生影響。而潛陽解毒通絡組和潛陽解毒通絡方聯合糜酶抑制劑組的大鼠血壓較SHR空白對照組則有不同程度下降，據此推測潛陽解毒通絡方除了通過調整腎素血管緊張素系統（RAS）發揮抗心肌肥厚和心肌纖維化的作用，還可能通過調節糜酶途徑發揮了抗心肌纖維化的作用。

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Qianyang Jiedu Tongluo Decoction on the Role of Myocardial Fibrosis Mechanism in Spontaneously Hypertensive Rats

CUI Yingzi1GUO Jiajuan1LI Xiang jun2WEI Yan3SONG Jing3, 1 the Hospital Affiliated to Changchun University of Traditional Chinese M edicine, Changchun 130021, China, 2 Pharmacy Co llege of Jilin University, Changchun 130021, China, 3 Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China

ObjectiveResearch of Qianyang Jiedu Tongluo（QYTL） decoction inhibition o f M yocardial tissue co llagen synthesis and m yocardial fibrosis to exp lore its mechanism in spontaneously hypertensive rats.MethodsThrough using the method of pathology, com pu ter analysis and reverse transcrip tion po lym erase chain reaction, the spontaneously hypertensive rats divided into QYTL group, Chy-I group, the QY＆ Chy-I group, SHR group, WKY group.Testing the systolic pressure, CVF, PVCA, the myocardial chym ase and co llagen I and III m RNA exp ression.ResultsCom pared w ith the WKY group, CVF and PVCA m RNA exp ression w as significantly inhibited（P＜0.01） in QYTL group, Chy-I group, the QY＆ Chy-I group.Com pared w ith the SHR group, the myocardial chym ase and collagen I and III m RNA expression w as significantly inhibited（P＜0.01） in QYTL group, Chy-I group, the QY＆ Chy-I group.Com pared w ith the SHR group, the systo lic p ressure w as significan tly inhibited（P＜0.01） in QYTL group and the QY＆ Chy-I group.ConclusionThe m yocardial chym ase invo lved in the synthesis of collagen, the formation and degradation of ECM, and p rom ote m yocardial fibrosis in spontaneously hypertensive rats, w hile QYTL could Inhibition myocardial fibrosis through the w ay of Inhibiting the myocardial chymase.

Qianyang Jiedu Tong luo decoction, M yocardial chym ase, Spontaneously hypertensive rats, M yocardial fibrosis, Collagen

R 242

B

1674-9308（2015）28-0178-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.28.131

1 130021 吉林省長春市長春中醫藥大學附屬醫院；2 130021吉林大學藥學院；3 130117 吉林省長春市長春中醫藥大學

教育部科學技術研究重點項目（211041）

郭家娟，E-mail：gjj-2005@163.com