響應面法優化紫山藥色素提取工藝

王衛東，朱連濤，孫月娥，高明俠

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇徐州 221111；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點實驗室，江蘇徐州 221111）

響應面法優化紫山藥色素提取工藝

王衛東1，2，朱連濤1，孫月娥1，2，高明俠1

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇徐州 221111；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點實驗室，江蘇徐州 221111）

以紫山藥為原料，采用溶劑提取法提取紫山藥色素。結果表明，紫山藥色素的最大吸收波長為540 nm，與丙酮和甲醇相比，體積分數為40%的乙醇對色素的提取率最高。以吸光值為指標，通過單因素試驗分別考察了液料比、溫度和提取時間等三個因素對紫山藥色素提取率的影響，在此基礎上采用響應面試驗設計對乙醇提取色素的工藝參數進行優化，確定最佳工藝條件為：液料比92（mL/g）、溫度58℃、提取時間128min。

紫山藥；色素；響應面法

山藥（Dioscorea opposita）學名薯蕷，為薯蕷科薯蕷屬植物，是我國衛生部公布的藥食兩用蔬菜。紫山藥屬于山藥的紫紅肉品種群，因其皮和肉質含有豐富的花色苷，因此呈現紫紅色[1]。紫山藥比一般的山藥含有更多的維生素和微量元素，特別是它有含多種花色苷，并含有大量的蛋白質、多糖、薯蕷皂甙元等較高營養物質及藥理成分[2]。花色苷是一類廣泛存在于高等植物中的天然水溶性色素，存在于很多水果、蔬菜和花朵中，呈現紅、藍、紫或者黑的色澤。花色苷不但可以作為天然色素，而且在抗氧化[3]、抗炎癥[4]、抗突變[5-6]、抗腫瘤[7]、改善視力[8]、預防和治療心血管疾病[9]等方面具有良好的作用。從紫山藥中提取的色素或者其他多酚類化合物，可作為功能性食品配料或者天然著色劑使用。唐曉偉等[10]采用快速溶劑萃取技術對紫山藥色素提取工藝參數進行了優化。倪勤學等[11]采用正交試驗法優化了溶劑提取法提取紫山藥色素的工藝參數。本文以新鮮的紫山藥為原料，采用溶劑提取法，利用Box-Behnken響應面試驗對紫山藥色素提取工藝進行優化，為紫山藥中色素的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫山藥：市售；乙醇：國藥集團上海試劑公司；其他試劑均為分析純。

722G型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；RE5299真空旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-15中藥粉碎機：溫嶺市大德中藥機械有限公司；LGJ―10真空冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預處理

新鮮的紫山藥清洗，瀝干，切片，冷凍干燥，粉碎，過40目篩，裝于密封袋中，4℃冷藏備用。

1.2.2 紫山藥色素最大吸收波長的測定

稱取0.1 g紫山藥粉末，加入體積分數為40%的乙醇100mL，超聲10min后離心。殘渣用40%乙醇重復提取，直到提取液清澈無色。合并提取液，上層水相在30℃下真空濃縮除去乙醇，用水定容到250mL。將一定濃度的提取液在紫外可見分光光度計上掃描，波長范圍為500 nm～700 nm，記錄最大吸收峰的位置。

1.2.3 提取溶劑對紫山藥色素提取率的影響

分別采用體積分數為0%、20%、40%、60%、80 %、100%的乙醇、丙酮、甲醇提取紫山藥中的色素，真空濃縮除去有機溶劑后定容到100mL，測定提取液吸光值，比較提取劑對色素的提取效果。

1.2.4 紫山藥色素提取工藝優化試驗設計

以體積分數40%的乙醇溶液為提取溶劑，以540 nm吸光值為指標，對液料比、提取時間、溫度進行單因素試驗。根據單因素的試驗結果，采用Box-Behnken試驗設計原理，以液料比、提取時間和溫度為影響因素，設計3因素3水平的響應面試驗。試驗因素與水平如表1所示。

表1 因素水平表Table1 Independent variables and levels for optimization

2 結果與分析

2.1 紫山藥色素的最大吸收波長

利用紫外-可見分光光度計掃描色素提取液，結果如圖1所示。可見，紫山藥色素的最大吸收波長在540 nm。曾哲玲等[12]采用40%的乙醇提取紫山藥色素，發現其在540 nm左右處出現特征吸收峰，與本實驗結果一致。所以后續實驗中通過測定540 nm處的吸光值評價色素的提取效果，吸光值越大，表明色素的提取率越高。

圖1 紫山藥色素的可見光譜圖Fig.1 Vis spectra of purple yam pigment

2.2 提取劑對色素提取效果的影響

分別取0.2 g的紫山藥粉末，以提取劑與紫山藥液料比為100∶1（mL/g）的比例，加入不同濃度的乙醇、丙酮、甲醇，在30℃下攪拌提取30min，離心后取上清液，真空濃縮除去有機溶劑，定容到100mL，測定其在540 nm波長處的吸光值，比較不同溶劑對色素提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 提取劑對色素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on pigment extraction yield

由圖2可見，各溶劑濃度低于50%（體積分數）時，乙醇對色素的提取率較高，其中以40%（體積分數）的乙醇提取效果最好；當各溶劑高于50%（體積分數）時，丙酮對色素的提取率較高，但隨提取劑濃度的增高呈現下降趨勢，故選擇40%（體積分數）乙醇為提取劑。

2.3 紫山藥色素提取單因素試驗

2.3.1 液料比對色素提取效果的影響

取0.2 g紫山藥粉末為原料，分別按液料比（m L/g）70、80、90、100的比例加入40%（體積分數）的乙醇溶液作為提取劑，30℃攪拌提取60min，離心后取上清液，測定其在540 nm波長下的吸光值。為消除由于提取劑體積增加對色素提取液濃度的稀釋，以液料比70為基準比例，其他比例下測得的吸光值換算成和它相同體積下的吸光值，比較液料比對提取效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 液料比對色素提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid：solid ration on pigment extraction yield

由圖3可見，隨著液料比的增大，提取液的吸光值也增加，當液料比達到90時，吸光值最大。此后當液料比繼續增加，吸光值基本不變，表明色素提取率不再增加。因此，當選擇液料比為90時，既有利于紫山藥色素的提取，也利于減少溶劑的浪費，減少后續濃縮步驟的成本。

2.3.2 提取溫度對提取率的影響

取0.2 g紫山藥粉末，按液料比90的比例加入40%（體積分數）的乙醇溶液作為提取劑，分別在30、40、50、60、70℃時攪拌提取60min，離心后取上清液，測定其在540 nm波長下的吸光值，比較溫度對提取效果的影響，結果如圖4所示。

圖4 提取溫度對色素提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of pigment

由圖4可見，在一定范圍內，隨著提取溫度的增加，紫山藥色素提取率不斷增加，當提取溫度達到60℃時，提取率達到最大，隨后再增加提取溫度，提取率反而降低了。這是因為紫山藥色素在較高溫度下發生了降解，吸光值減小。因此，選擇提取溫度為60℃。

2.3.3 提取時間對色素提取率的影響

取0.2 g紫山藥粉末，按液料90的比例加入濃度為40%（體積分數）的乙醇作為提取劑，60℃恒溫攪拌提取30、60、90、120min，離心后取上清液，測定其在540 nm波長下的吸光值，比較提取時間對提取效果的影響，結果如圖5所示。可見，隨著提取時間的增加，色素的提取率不斷增加。當提取時間為120min時，提取率達到最高。因此選擇提取時間為120min。

圖5 提取時間對花色苷提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction yield of ACN

2.4 紫山藥色素提取的最佳工藝參數

2.4.1 響應面試驗模型的建立及其結果

根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取提取溫度（X1）、液料比（X2）和提取時間（X3）三個影響因素，采用三因素三水平的響應曲面試驗設計對花色苷提取率（y）進行優化[13]。設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：

式中：B0為常數項，Bi為線性系數；Bij為交互項系數；Bii為二次項系數；ε為隨機誤差。按照 Box-Behnken試驗設計的統計學要求，對上述方程的各項回歸系數進行回歸擬合。試驗設計與結果見表2。

表2 試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with the observed responses

利用Design expert V 8.0統計軟件通過逐步回歸對表2中的試驗數據進行回歸擬合，得到吸光值對以上 3個因素的二次多項回歸模型為：Y=1.43+ 0.093X1-0.18X2+0.13X3+0.022X1X2-0.01X1X3+0.025X2X3-0.19X12-0.46X22-0.25X32。對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 二次回歸方程模型方差分析Table3 ANOVA for the regression model

由表3可知，模型具有高度顯著性（P＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05）以及RSN（信噪比）為17.416，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，實驗誤差較小，故可用此模型對紫山藥色素提取的工藝結果進行分析和預測。根據統計學計算原理可知，回歸方程相關系數R2為0.982 3，說明模型能解釋98.23%響應值的變化，說明該模型與實際實驗擬合程度良好，用該模型對乙醇提取紫山藥色素的提取過程進行優化是合適的。

2.4.2 響應曲面分析與優化

根據回歸方程，作響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析液料比、溫度以及提取時間對色素提取率的影響。模型的響應面及其等高線如圖6、圖7和圖8所示。

等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[14]。比較3組圖并結合表3中p值可知：模型的一次項X1（p＜0.05）顯著，X2、X3（p＜0.01）高度顯著，交互項均不顯著（P>0.05）；二次項均高度顯著（p＜0.01）。因此，各影響因素對紫山藥色素的影響不是簡單的線性關系。液料比、溫度和提取時間對提取率有顯著的影響，各因素之間的交互作用對提取率沒有造成顯著影響。

圖6 液料比、溫度對色素提取率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour plot showing effect of liquid: solid ration and temperature on extraction yield of pigment

圖7 提取時間、溫度對色素提取率影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour plot showing effect of time and temperature on extraction yield of pigment

圖8 提取時間、液料比對色素提取率影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface and contour plot showing effect of time and liquid:solid ration on extraction yield of pigment

為進一步確定最佳提取工藝參數，采用Design expertV 8.0統計軟件對模型進行優化求解，可得最佳工藝參數為液料比92∶1（mL∶g），溫度58℃，提取時間128min，此時紫山藥色素提取液吸光值為1.477。

2.4.3 驗證實驗

為檢驗Box-Behnken試驗設計所得結果的可靠性，采用上述最優提取條件進行紫山藥色素的提取實驗，在此條件下進行3次平行實驗，實際測得提取液的平均吸光值為1.489，與預測值基本相符，因此，基于Box-Behnken試驗設計所得的最佳工藝參數準確可靠，具有實用價值

3 結論

紫山藥色素最大吸收波長為540 nm，不同提取劑對其提取效果不同，40%（體積分數）乙醇溶液提取效果最好。液料比、溫度和提取時間對紫山藥色素提取率有顯著影響，由單因素和Box-Behnken試驗設計及其分析結果獲得乙醇提取紫山藥色素的最佳工藝參數為液料比92∶1（g∶mL），溫度58℃，提取時間128min。

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Optimization of Extraction of Purple Pigment from Yam Using Response Surface Methodology

WANG Wei-dong1，2，ZHU Lian-tao1，SUN Yue-e1，2，GAO Ming-xia1
（1.College of Food and Biological Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，Jiangsu，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Exploitation of Food Resources and Food Quality Safty，Xuzhou 221111，Jiangsu，China）

Purple yam pigment was extract by solvent extraction method.The results indicated that aqueous alcohol extracts produced the absorption maximas at 540 nm.A aqueous alcohol concentration of 40%（v/v）extracted maximum pigments，compared with acetone and methanol.Effects of three factors of liquid：solid ratio，temperature and extraction time were studied.Based on it，conditions of extraction were optimized by response surface design.The optimum conditions of extraction were a liquid∶solid ratio of 92∶1（mL/g），temperature of 58℃and extaction time of128min.

purple yam；pigment；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.005

2013-12-07

國家科技富民強縣專項行動計劃項目（BN2012105）

王衛東（1971—），男（漢），副教授，研究生，研究方向：功能性食品配料與添加劑。