涼茶中DNA提取方法的建立

王立平，蔡雪鳳，劉曉莉，曹悅，李樹垚

（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京100094）

涼茶中DNA提取方法的建立

王立平，蔡雪鳳，劉曉莉，曹悅，李樹垚

（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京100094）

以涼茶植物源性飲品為研究對象，比較了1種硅膠柱法商品試劑盒和傳統CTAB法提取涼茶食品基因組DNA的效果；通過紫外分析法和實時熒光定量PCR法對所提取的DNA進行檢測，比較所得DNA的濃度和純度，以及對下游檢測的適用性。結果表明，與傳統CTAB法相比，研究所建立的方法提取到的DNA無PCR抑制劑，濃度和純度能滿足后續PCR檢測要求。

涼茶；核酸提取；方法比較

涼茶是我國南方沿海地區居民根據當地氣候、水土特性，在長期預防疾病與保健的過程中以中醫養生理論為指導，以天然中草藥，如金錢草、布渣葉、崗梅根、木蝴蝶、火炭毋、淡竹葉、金沙藤、五指柑等為原料，用獨特的煲制方法煎熬而成的一種湯劑，具有清熱解毒、生津止渴、防治疾病等功效，也是民間世代流傳的被廣泛飲用的傳統保健飲品。但目前在涼茶原材料來源上存在一些問題，如藥材種類摻假。炒的沸沸揚揚的金銀花門事件，就是用價格低廉的山銀花冒充金銀花。要實現對涼茶中中草藥成分真實性鑒定可借助于PCR（聚合酶鏈式反應）技術手段。通過提取殘留于涼茶中的特定藥材的DNA（脫氧核糖核酸）片段，設計適宜引物，擴增目標片段，借助瓊脂糖電泳技術或實時熒光定量PCR技術可實現中藥材真實性鑒定。

但PCR方法鑒定準確性與穩定性的重要前提條件是所提取DNA的濃度和質量，而這取決于DNA提取方法，特別是對PCR抑制劑的有效去除。已報道的PCR抑制劑有：NaCl、二價鹽、SDS（十二烷基磺酸鈉）、糞便中的多糖、尿中的尿素、血液中的血紅素、牛奶中的蛋白酶、土壤中的腐殖質等等[1-2]。這些抑制劑一般是通過以下幾種方式單一或混合進行抑制：（1）干擾細胞裂解；（2）解或捕獲核酸；（3）使DNA聚合酶失活或活性降低[1，3]。

涼茶中成分復雜，工藝過程需經過加熱熬制，導致植物DNA片段斷裂和破碎；涼茶中所生成的色素成分對后續PCR反應過程所產生的抑制作用，導致PCR檢測的失敗。因此，所采用DNA提取方法，獲取高純度的目標DNA片段至關重要。

目前在植物源食品中提取DNA的方法主要有傳統CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法，SDS法，硅膠柱試劑盒法，磁珠試劑盒法[4-5]。但如何獲取涼茶中高質量的DNA的提取方法至今尚無研究報道。在本實驗中考慮到PCR抑制劑的影響，采用了硅膠柱提取DNA的方法，并與傳統CTAB法加以比較，確定最適宜的涼茶中DNA的提取方法。

1 材料與方法

1.1 試劑材料及儀器設備

1.1.1 試劑材料

市售不同品牌的涼茶；FeCl3·6H2O；乙二醇、三乙二醇、醋酸鈉；十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇8000、四乙氧基硅烷（TEOS）；CTAB；NaCl；蛋白酶K；鹽酸胍；瓊脂糖；PCR試劑（天根生物技術公司）；D Neasy mericon Food Kit（QIAGEN）；DNA marker（50 bp～450 bp）。

1.1.2 引物和探針

PCR采用植物18SrDNA基因為靶序列的引物[6]。上游引物：5’-CCTGAG AAA CGGCTA CCA T-3’下游引物：5’-CGT GTC AGG ATT GGG TAA T-3’探針：5’FAM-TGC GCG CCT GCT GCC TTC CT-3'TAMRA。

1.1.3 儀器設備

凝膠成像系統（BIO-RAD，美國）；核酸蛋白微量定量儀（Nano Drop，美國）；高速離心機（SIGMA，德國）；實時熒光PCR儀（ABI7300，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 兩種涼茶中DNA提取方法

CTAB法：見參考文獻[7]；Qiagen硅膠柱法：實驗步驟見說明書。

1.2.2 提取基因組DNA的紫外分光光度檢測

用紫外分光光度計檢測基因組DNA在260 nm處的吸光值（A260），計算所提DNA的濃度，DNA的質量濃度（μg/mL）=A260×50。檢測基因組DNA在260、280 nm處的吸光值，根據A260/A280值判斷DNA純度。

1.2.3 Rea1-Time PCR初步擴增體系

反應體系為25.0μL。Master Mix：10μL；上、下游引物（10μmol/L）：各1.0μL；分子信標探針（5.0μmol/L）：1μL；probe Enhancer solution：1.25μL；DNA模板：10.75μL。實時熒光反應條件：50℃2min；95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環。每個模板DNA均做2個平行。

1.2.4 檢測抑制劑

以提取的樣品DNA液8.75μL為抑制劑，以大豆提取的DNA為陽性模板，按1.2.3Rea1-Time PCR進行擴增檢測，確定所提取的樣品DNA中是否有PCR抑制劑的存在和干擾。

2 結果與討論

2.1 兩種DNA方法提取結果的比較

涼茶是中草藥深加工制品，DNA在加工過程中不可避免受到損傷、斷裂和降解。且所含的植物多糖和色素，對提取樣品總DNA效率及純度產生一定影響，進而影響下一步實驗結果的判定。因此，采用兩種方法提取涼茶中的DNA，比較結果見表1。

表1 涼茶中總DNA提取方法比較（DNA濃度為（ng/μL））Table 1 Comparison of QIAquickRSpin Columns DNA extraction kit and CTAB method

從表1中可看出，不同的DNA提取方法所獲取DNA提取液的濃度和純度存在一定差異。在DNA提取液顏色上，傳統CTAB法DNA提取液呈淡黃色，而采用Qiagen硅膠柱法提取的DNA為正常的無色透明液體。在260/280的比值方面，兩種DNA提取液的260/280的比值范圍波動較大，傳統CTAB法提取液260/280的比值在0.98～1.15之間?？赡苁窃谔崛∵^程中植物多糖去除效果不好，導致DNA提取液中植物多糖含量高。提取液中DNA濃度差別較大，從幾ng/μL～幾十ng/μL不等。從以上結果看到，不同的DNA提取方法，由于所采用的機理不同，提取的效果確實存在一定差異。考慮到涼茶為深加工制品，植物中DNA在產品加工生產過程中的加熱熬制導致DNA降解，斷裂為小片段。因此，DNA提取液的260/280的比值、顏色及濃度可為下一步實驗提供參考。

2.2 兩種方法提取DNARea1-Time PCR結果

以兩種方法提取的涼茶的基因組DNA為模板，采用植物18SrDNA序列設計的引物和探針分別對市售的三種涼茶提取的DNA進行Rea1-Time PCR擴增測定，確定兩種提取方法的可行性，結果見圖1和圖2。

圖1 CTAB法Real-Time PCR擴增曲線Fig.1 The curve of Real-Tim e PCR by CTAB method

圖2 Qiagen硅膠柱法Real-Time PCR擴增曲線Fig.2 The curve of Real-Time PCR by Qiagen spin columns DNA extraction method

從Rea1-Time PCR擴增曲線可知，除陽性對照有明顯擴增曲線外，采用Qiagen硅膠柱提取試劑盒提取的三種涼茶DNA有擴增曲線；而傳統CTAB法獲取的三種涼茶DNA均無明顯的擴增曲線；從2.1中測定結果可知，采用Qiagen硅膠柱提取試劑盒提取的三種涼茶DNA含量低于傳統CTAB法。因此推測傳統CTAB法獲得的DNA液中可能存在PCR抑制物質。所做的推測有待下一步實驗進行驗證。

2.3 抑制劑檢測結果

以大豆提取的DNA為陽性模板，在Real-Time PCR反應體系（25.0μL）中添加體積為2.0μL（100.0 ng/μL），同時在每個反應體系中添加8.75μL的傳統CTAB法獲取的三種涼茶DNA液，添加引物、探針及Master mix后進行Real-Time PCR，檢測DNA提取液中是否存在PCR抑制劑。結果見圖3。

圖3 CTAB法抑制劑Real-Time PCR擴增曲線Fig.3 The curve of Real-Time PCR by CTAB method containing PCR inhibitors

從圖3的Rea1-Time PCR擴增曲線圖可知，除陽性對照有明顯擴增曲線外，傳統CTAB法提取的三種涼茶DNA均含有PCR抑制劑，導致添加該三種方法提取的DNA液的陽性樣品無擴增曲線。該結果表明，傳統CTAB法不能有效去除樣品中PCR抑制劑，特別是色素類的PCR抑制劑。目前，對于如何去除DNA提取液中PCR抑制劑有相關的研究報道[8]。利用去除PCR抑制劑物質能否有效去除DNA提取液中PCR抑制劑有待下一步研究。

3 結論

涼茶含有糖類、蛋白質類、及色素類物質等，這些物質直接影響著PCR以及熒光PCR反應中Taq酶的活性，并且對熒光PCR的定量結果有著更大的影響。因此建立提取該類產品基因的方法得到質量較好的基因組DNA至關重要。本實驗中，與傳統CTAB法相比較，Qiagen硅膠柱提取法在獲取目標DNA片段更具優勢，能獲得較好質量的涼茶產品中的DNA片段，能滿足下一步實驗的要求。

[1] Waleed A A,Peter R.Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-Inhibiting samples[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(10):3748-3753

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[3] Wilson I G.Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification [J].Appl Environ Microbiol,1997,63(10):3741-3751

[4] Clelia Peano,Maria Cristina Samson,Luisa Palmieri.Qualitative and quantitative evaluation of the genomic DNA extracted from GMO and Non-GMO food stuffs with four different extraction methods[J].Agricultural and Food Chemistry,2004,52(23):6962-6968

[5] Philippe Corbisier,Wim Brootharets,Sabrina Gioria.Toward metrological traceability for DNA fragment ratios in GM quantification.1. Effect of DNA extraction methods on the quantitative determination of Bt176 Corn by Real-Time PCR[J].Agricultural and Food Chemistry,2007,55(9):3249-3257

[6] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局中國國家標準化管理委員會.SN/T 1204-2003植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法[OL].http://down.foodnate.ne/standard/sort/4/9362.htm l.[2003-03-17]

[7]邵碧英,王德峰,傅碧忠,等.醬油、烤鰻醬油DNA提取及原料成分的熒光PCR檢測[J].食品科學,2009,30(22):240-243

[8]Matina Kovarova,Petr Draber.New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions[J].Nucleic Acids Research,2000,28 (13):1-5

DNA Extraction Methods of Herbal Tea

WANG Li-ping，CAI Xue-feng，LIU Xiao-li，CAO Yue，LI Shu-yao
（China National Food Quality＆Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Two current DNA extraction methods for processed foods of herbal tea were compared in the study. These methods included one kind of QI AquickRSpin Columns DNA extraction kits and CTAB method.The extracted DNA were detected to compare concentration，purity and suitability to posterior detection by UV analysis，fluorescence quantification PCR.The results showed that the purity of and concentration extracted DNA from herbal tea was without PCR inhibitor by our established method and could meet the requirement of posterior PCR detection.

herbal tea；DNA extraction；methods comparison

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.022

2013-12-11

王立平（1968—），女（蒙古），高級工程師，博士，主要研究方向：食品微生物。