食用菌深層發酵物中生物活性物質含量的比較

金紅，楊孝麗，任燦，徐娜，王英超，張斌

（1.天津農學院農學與資源環境學院，天津300384；2.天津農學院基礎科學學院，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

食用菌深層發酵物中生物活性物質含量的比較

金紅1，楊孝麗1，任燦1，徐娜1，王英超2，張斌3，*

（1.天津農學院農學與資源環境學院，天津300384；2.天津農學院基礎科學學院，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

食用菌深層發酵物中含有很多與免疫相關的生物活性物質。本文以白靈菇、金針菇、茶樹菇、平菇、香菇、桑黃、云芝和灰樹花八種食用菌為實驗材料，利用搖瓶深層發酵技術，對相同發酵條件下，8種食用菌發酵物中的胞外多糖、胞內多糖、黃酮、總酚、VC和可溶性蛋白含量進行了比較。結果表明，灰樹花深層發酵物中總多糖產量最高為0.349g/100mL，桑黃中的黃酮和可溶性蛋白的產量最高分別為3.92μmol/100mL和0.58mg/mL，云芝中的VC產量最高為19.95 g/100mg，金針菇的總酚產量最高為5.07mg/100m L。通過比較，白靈菇的綜合指標表現最好，以白靈菇為實驗材料進行發酵罐深層發酵，比較搖瓶與發酵罐深層發酵液中各物質的含量變化。結果表明，在發酵罐條件下，白靈菇的胞外多糖和胞內多糖產量明顯提高，但黃酮和VC產量增幅不大，說明發酵條件對發酵物中活性物質產量有很大的影響。

食用菌；深層發酵；多糖；黃酮；VC

食用菌深層發酵技術是一種新型的技術，具有周期短、產量高、產生的活性物質多、菌體污染少等特點[1]。我國擁有極其豐富的高等真菌資源，隨著現代科學技術的發展，目前，食用菌深層發酵技術日趨成熟，但如何有效地利用深層發酵物中的生物活性物質仍處于研究階段，多數以研究單一菌種的發酵技術為主[2]。摸清一些常用食用真菌深層發酵液中生物活性物質的成分，特別是對它們的發酵液成分作以橫向比較，對這些活性物質進行有效的混合利用，開發功能食品和生物制劑具有主要意義。由于食用菌發酵物中含有多種與免疫相關的活性物質，對提高機體的免疫技能，克服抗生素和疫苗的副作用，具有較好的作用。本文以8種常見食用菌為研究材料，通過搖瓶深層發酵培養，測定其發酵液中多糖、黃酮等多個與免疫相關的物質含量，篩選出各指標較高的食用菌，并對其進行發酵罐深層發酵初探，為食用菌深層發酵物的混合加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

食用菌：白靈菇、金針菇、茶樹菇、香菇、平菇、云芝、桑黃和灰樹花：均由天津農學院農學與資源環境學院生物技術系班立桐老師惠贈。

1.2 主要設備和儀器

75-23型可見分光光度計：天津喀納斯光學分析儀器有限公司；HZQ-Q型全溫振蕩器：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；LGJ-18S型冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；TGL16A型高速冷凍離心機：福建凱達集團有限公司；GBJT-7AUTOBIO2000型7L發酵罐：鎮江東方生物工程設備技術公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制

1.3.1.1 種子培養基

1%蔗糖、0.5%蛋白胨、0.05%KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、10mg/LVB1；

1.3.1.2 搖瓶深層發酵液體培養基

3%蔗糖、2%玉米粉、4%麩皮、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O；

1.3.1.3 白靈菇發酵罐深層發酵液體培養基

0.5%葡萄糖、0.5%蔗糖、5%玉米粉、4%麩皮、0.2%蛋白胨、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.5%羧甲基纖維素鈉、VB1微量。

1.3.2 8種食用菌搖瓶深層發酵培養方法

取0.5 cm2大小的各菌塊接種在斜面培養基的中部，25℃下暗培養。待各菌生長旺盛時，各取2塊0.5cm2大小的菌塊分別接種到相應的100mL種子液培養基中，25℃，170 r/min搖床培養7 d。取10mL各菌種的種子液分別接種到相應的90m L發酵培養基中，25℃，170 r/min搖床繼續培養7 d。

1.3.3 8種食用菌發酵液多糖的提取及含量測定

將發酵液于3 600 r/min離心20min，取下層沉淀，用蒸餾水沖洗3次，放入60℃干燥箱中烘至恒重。將恒重的菌絲體研磨成粉末用于提取胞內多糖，方法參照文獻進行[3-4]。提取胞外多糖時，將發酵液3 600 r/ min離心20min，收集上清液。60℃旋轉蒸發濃縮至1/ 4體積，加入3倍體積預冷的95%乙醇，于4℃冰箱中醇析24 h，4 200 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀分別用無水乙醇、乙醚和丙酮清洗數次，然后再加入一定體積60℃熱水，使沉淀充分溶解，得胞外多糖溶液。多糖含量的測定參照文獻進行[5-7]。

1.3.4 8種食用菌發酵液中黃酮和總酚的提取和含量測定

取發酵液于3 600 r/min離心20min。取15mL上清液于-20℃冰箱中凍實，然后放入冷凍干燥機24 h，待濃縮至原液1/5，停止干燥。黃酮的測定方法采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，參照文獻進行[8]；測定總酚時，將發酵液全部轉入離心管中，3 000 r/min離心15min，取上清。將樣品濃縮到吸光度值范圍內。測定方法參照文獻進行[9]。

1.3.5 8種食用菌發酵液中VC的含量測定

取發酵液于3 600 r/min離心20min，取上清液40mL置于冷凍干燥機干燥成粉末后，2%草酸溶解，定容至40m L。含量測定采用2，6-二氯酚靛酚法，參照文獻進行[10]。

1.3.6 8種食用菌發酵液中菌絲體干重和可溶性蛋白含量的測定

將發酵液于3 000 r/min離心10min，得到菌絲體，攪碎，用蒸餾水洗滌3次，3 000 r/min離心10min后，60℃烘干至恒重，菌絲體干重測定參照文獻進行[8]；測定可溶性蛋白時，將發酵液轉入離心管中，3 000 r/min離心15min，取上清。參照文獻的方法進行[10]。由于樣品顏色較深，將樣品稀釋到吸光度值范圍內。

1.3.7 白靈菇發酵罐深層發酵條件

7 L發酵罐裝培養基4.5 L，接種量10%，溫度25℃，初始攪拌轉速300 r/min，pH 6，罐壓0.08MPa，通氣量1 vvm，通過改變轉速和增加罐壓調節溶氧，發酵培養5 d。

2 結果與分析

2.1 8種食用菌搖瓶發酵液中多糖的比較分析

取8種食用菌的搖瓶深層發酵液，按照1.3.3的方法分別提取胞內多糖和胞外多糖和測定其含量，結果見表1。

從表1中可以看出，八種食用菌深層發酵物中胞外多糖和胞內多糖含量高低呈現出大致相同的趨勢，胞外多糖含量從高到低前三名依次為香菇>灰樹花>白靈菇，胞內多糖含量從高到低前三名依次為灰樹花>白靈菇>金針菇。說明在本研究中采用相同的實驗條件下，該實驗條件比較適合香菇深層發酵物胞外多糖的產生，達0.134 g/100mL，是產量最低的云芝的2.39倍；也比較有利于灰樹花深層發酵物中胞內多糖的產生，達到0.218 g/100mL，是產量最低的云芝的4.11倍。而多糖總含量則是灰樹花的最高，達到0.349 g/100mL，其次是白靈菇和香菇。日本學者通過對灰樹花發酵液成份的研究發現：其中的灰樹花胞外多糖是發酵液主要的生物活性成份[11]。大量的藥理藥效的研究證明，灰樹花胞外多糖在抗腫瘤、抗HIV病毒以及防治糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖癥、老年癡呆癥等方面具有良好的效果，有些方面甚至超過臨床效果較好的香菇多糖。

表1 8種食用菌搖瓶深層發酵液中多糖含量的比較Table1 Comparison of contents of polysaccharides of eight edible fungus fermentation products

2.2 8種食用菌搖瓶發酵液中黃酮和總酚含量的比較分析

取2種食用菌的搖瓶深層發酵液，按照1.3.4和1.3.5的方法分別測定黃酮、總酚和VC的含量，結果見表2。

表2 8種食用菌搖瓶深層發酵物中黃酮、總酚和VC的含量比較Table 2 Comparison of contents of flavonoids,total phenols and VCin eight edible fungus fermentation products

從表2可以看出，8種食用菌深層發酵也中黃酮含量相對差異變化不是很大，變化范圍為2.72μmol/ 100m L～3.92μmol/100m L。高低前三名的依次為：桑黃>白靈菇>平菇；總酚含量前三名為：金針菇＞灰樹花＞平菇。金針菇的總酚含量最高為5.07mg/100mL，是最低的白靈菇總酚含量的5倍；維生素C含量則差異很大，變化范圍達到1.77mg/100mL～19.95mg/100mL，VC含量前三名依次為云芝＞白靈菇＞金針菇。

2.3 8種食用菌搖瓶發酵液中菌絲干重和可溶性蛋白含量的比較分析

取8種食用菌的搖瓶深層發酵液，按照1.3.6的方法分別測定可溶性蛋白含量以及菌絲體干重，結果見表3。

表3 8種食用菌搖瓶深層發酵物中可溶性蛋白含量和菌絲體干重的比較Table3 Comparison of contents of soluble protein and dry weight of mycelium of eight edible fungus fermentation products

由表3可以看出，這8種樣品的發酵上清液中均含有蛋白質，且含量由大到小的順序為：桑黃＞云芝＞白靈菇＞平菇＞金針菇＞香菇＞茶樹菇＞灰樹花。桑黃蛋白質含量最高，即0.579 2mg/mL，云芝和白靈菇也很高，分別為0.292 2mg/mL和0.284 5mg/mL，而且相差不大。灰樹花的蛋白質含量最低為0.157 1mg/mL。桑黃的蛋白質含量是灰樹花的4倍。從菌絲體干重看，這8種發酵液的菌絲體干重由大到小的順序為：白靈菇＞金針菇＞平菇＞灰樹花＞茶樹菇＞香菇＞桑黃＞云芝。白靈菇的菌絲體干重最高為1.92 g/100m L，而云芝菌絲體干重最低為0.71 g/100mL。

2.4 白靈菇發酵罐深層發酵下多糖等物質含量的變化

通過比較表1～表3，對八種食用菌搖瓶深層發酵液中的多糖、黃酮、總酚、VC和可溶性蛋白含量等5個指標進行綜合比較，表現較好的為白靈菇。所以，為了探討在發酵罐深層發酵條件下，是否會提高各種物質的含量，選取白靈菇作為發酵罐深層發酵的菌種。經發酵罐深層發酵后分別測定各物質的含量，結果見表4。

從表4中可見，以發酵罐的方式進行深層發酵，發酵液中各物質的產量均有提高，但增加的幅度不同，胞外多糖和胞內多糖的產量分別增加了3.12倍和1.86倍，而總多糖含量增加了3.29倍；總酚量增加2.44倍；黃酮、和VC產量增加的幅度略小些，說明該發酵條件下比較適合于多糖的產生，而對黃酮、可溶性蛋白和VC產量的增加不太適合。發酵時不同的發酵方式，會對發酵產物含量產生較大的影響。

表4 白靈菇在搖瓶和發酵罐兩種深層發酵條件下發酵液中各物質含量的比較Table4 Comparison of contents of materials above from pleurotus nebrodensis submerged ferments under two different conditions

3 結論與討論

1）從8種食用菌搖瓶深層發酵液中各指標的測定結果可以得出，在發酵條件、培養時間相同時，灰樹花深層發酵物中總多糖和胞內多糖產量最高，桑黃中的黃酮和可溶性蛋白產量最高，云芝中的VC產量最高，金針菇的總酚產量最高。由于每種食用菌具有各自最適的培養條件，如pH、溫度、轉速及生長周期等，為了比較八種菌的發酵物中各物質的產量，本研究采用了相同的培養條件。但同時也出現一個問題，就是測定時各種代謝產物可能不是其產量最高的時期，如測定桑黃深層發酵物中黃酮的含量時，第9天的黃酮含量0.0416μmol/mL，稍高于第7天測定時的0.0392μmol/mL。所以，針對具體的食用菌種發酵液中某個物質應選用其最適的發酵條件。

2）搖瓶發酵和發酵罐發酵是深層發酵的兩種方式。從兩種條件下深層發酵物中各指標含量的結果可以發現，發酵罐具有明顯的優勢。它可以通過補料，調節pH、溫度、溶氧等使食用菌處于最佳的生長狀態，同時也便于在線觀測參數變化，更好地掌握發酵周期，及時取樣和下罐。通過白靈菇兩種深層發酵方式的測定結果可以看出，培養基的碳源、氮源以及培養時間發生變化時對多糖、黃酮和VC等的產量有不同的影響，其中多糖產量大幅度提高，而黃酮和VC的產量增幅不大，這可能是由于碳氮源的變化更有利于多糖的產生，也可能是發酵時間太短，諸如黃酮和VC等次級代謝產物還未大量積累。培養基中的營養物質和環境因素很大程度上影響著發酵物中次生代謝物的產量，所以發酵培養基中的碳源、氮源、無機鹽和生長因子以及發酵條件如裝液量、接種量、起始pH、培養溫度、轉速和接種菌齡對食用菌深層發酵物產量都可能產生重要的影響，這一點有待于進一步研究。

3）食用菌深層發酵過程中產生的諸如多糖、黃酮、總酚和VC等具有生理活性的物質對于提高免疫、抗腫瘤、抗細菌病毒均有作用。如VC可起預防、促進免疫球蛋白合成、提高白細胞吞噬能力等作用。如吞噬細胞對VC的需求比其他細胞高出50倍。據查，獼猴桃的VC含量為62mg/100 g，辣椒的為59mg/100 g，而本研究中云芝的搖瓶發酵液和白靈菇的發酵罐深層發酵液中的VC含量就可達到19.95mg/100 g和16.10mg/100 g?？梢?，合理利用食用菌深層發酵液并進行混合使用，用于制備免疫增強的功能食品將會產生很可觀的社會效益和經濟效益。

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The Comparison of the Contents of Bioactive Substances in Edible Fungus by Submerged Ferments

JIN Hong1，YANG Xiao-li1，REN Can1，XU Na1，WANG Ying-chao2，ZHANG Bin3，*
（1.College of Agronomy and Resources Environment，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；2College of Basic Sciences，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；3.Tianjin Institute of Food Co.，LTD.，Tianjin 301609，China）

The submerged ferments of edible fungus contain many biologically active substances related to the immune.In this study，we made a compared research about the contents of extracellular polysaccharides，intracellular polysaccharides，flavonoids vitamin C and soluble protein of eight edible fungus including pleurotus nebrodensis，flammulina velutipes，agrocybe cylindracea，pleurotus ostreatus，lentinula edodes，phellinus，coriolus versicolor and grifola frondosa under the flask cultural condition of submerged fermentation. Results showed that The total yield of polysaccharide of grifola frondosa，flavonoids and soluble protein yield of phellinus，the yield of vitamin C of coriolus versicolor，the yield of total phenols of flammulina velutipes reached the top，they were respectively 0.349 g/100m L，3.92μmol/100m L and 0.58mg/m L，19.95 g/100mg，5.07 mg/100 mL.By comparison，pleurotus nebrodensis showed the best among all comprehensive targets. Next，the pleurotus nebrodensis was cultivated in a stirred-tank bioreactor.The contents of extracellular polysaccharides and intracellular polysaccharides were obviously increased，but the contents of flavonoids and vitamin C were increased a little，which was noted that the fermentation condition had a great effect on the contents of fermentation products.

edible fungi；submerged fermentation；polysaccharide；flavonoids；vitamin C

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.023

2014-10-23

天津市市級大學生創新創業訓練計劃項目（201410061092）

金紅（1967—），女（漢），研究員，碩士，研究方向：轉基因檢測與生物分離工程。

*通信作者：張斌（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：保健功能食品加工與評價。