鮐魚水溶性蛋白的提取及其揮發性成分分析

周家萍，張文濤，孟 夢，王躍猛，劉安軍，鄭 捷

鮐魚水溶性蛋白的提取及其揮發性成分分析

周家萍1，張文濤2，孟 夢2，王躍猛2，劉安軍2，鄭 捷2

（1.天津科技大學現代分析技術研究中心，天津 300457；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

以鮐魚為原料，通過單因素試驗和響應面試驗，確定鮐魚水溶性蛋白的最佳提取工藝條件為料液比1∶6.6（g/mL）、提取溫度27.7 ℃、提取時間3.8 h，得到的水溶性蛋白提取率為76.12%。將鮐魚原料和水溶解后樣品采用氣相色譜-質譜儀進行揮發性成分分析，結果表明，水溶性蛋白揮發性成分醇類物質含量降低，酮類、醛類、呋喃類物質含量都有了明顯提高。樣品經過冷凍干燥后，呈淡黃色或黃色粉末，蓬松柔軟，易吸濕，易溶于水，水溶液性質穩定，略有魚香味。

鮐魚；水溶性蛋白；氣相色譜-質譜法

鮐魚（Pneumatophorus japonicas），鱸形目，屬于鯖科，鮐屬。別名鮐鲅魚、青花魚、鯖魚等，為遠洋暖水性中上、層高產量的洄游性魚類，是我國目前近海主要捕撈的經濟魚種之一[1-4]。鮐魚分布廣、生長快、產量高，具有食物鏈較低、生命周期短、繁殖能力強、生長迅速、資源恢復能力強的特點，是城鄉群眾喜食的魚類[5]。鮐魚魚肉厚實，魚刺少，非常適合進行深加工。同時，研究表明，鮐魚是一種營養豐富的魚類，每100 g鮐魚肉中，含蛋白21.4 g、脂肪7.4 g、碳水化合物0.1 g、灰分1.1 g、鈣20 mg、磷226 mg、煙酸9.7 mg[6]，由此可見，鮐魚具有較高的營養價值。鮐魚體內還含有兩種營養價值很高的不飽和脂肪酸：二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。EPA和DHA具有促進嬰幼兒和青少年智力發育、抗血小板凝聚、延緩血栓形成、預防心血管疾病、降血脂、抗動脈硬化、抑制腫瘤生長、減少癌癥發病率等保健作用。因此，研究和開發利用經濟價值較低的鮐魚資源，對其進行深加工，提高其附加值，具有明顯的經濟效益和社會效益[7-9]。

魚品加工過程中會產生大量富含蛋白的有機廢水，其蛋白質量濃度可達到5～30 mg/mL（鮮牛奶的蛋白提取量約為28 mg/mL），直接排放不僅嚴重污染水體，同時造成極大的資源浪費[10-12]。漂洗作為魚品加工的重要環節，可去除魚肉中的有色物質、腥臭成分、脂肪、血液、水溶性蛋白等[13]。然而，漂洗液中大量的水溶性蛋白如何回收利用，一直是人們非常關注的議題。目前，漂洗液中蛋白的回收方法研究尚處于起步階段，主要有膜分離法[14]、離子交換法[15]、絮凝法[16]、調節pH值法[17]、電阻加熱法[18]等，其中大部分方法成本較高，實際生產中較難實現。

本研究以鮐魚為試材，采用低成本的調pH值法回收漂洗過程中流失的水溶性蛋白，旨在全面開發飴魚營養價值，制備具有高效生物活性的蛋白物并開發系列保健食品，對鮐魚乃至水產品深加工具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮐魚購于華海批發有限公司，-20 ℃冷藏。

鹽酸、硫酸、無水葡萄糖、無水乙醇、磷酸氫二鉀（分析純） 天津江天化工技術有限公司；考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Sp-2120型紫外-可見分光光度計、RE-52A旋轉蒸發器 上海光譜儀器有限公司；HW·SY系列電熱恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司；752紫外-可見分光光度計 上海光學儀器廠；凱氏定氮儀 上海新嘉電子有限公司；LD4-40型臺式離心機 北京醫用離心機廠；4000MS氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀 美國瓦里安技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

取冰鮮的鮐魚進行解凍后宰殺，去頭部、內臟及魚尾后，將魚身冷藏于-20 ℃冰箱中備用，實驗時常溫自然解凍。每個單因素試驗都采用同一批原料。

1.3.2 鮐魚水溶性蛋白的提取[19]

鮐魚解凍，切塊，按一定的料液比與蒸餾水進行混合，混合物于均質機中均質5 min，于25 ℃浸提24 h，室溫4 390×g離心10 min取上清液，所得蛋白溶液置于-20 ℃冰箱冷凍，待冷凍干燥后，即得水溶性蛋白粉。

1.3.3 鮐魚水溶性蛋白成分測定

取凍干后的水溶性蛋白粉進行成分測定，采用105 ℃干燥質量恒定法測定水分含量，索氏抽提法測定粗脂肪的含量，微量凱氏定氮法測定粗蛋白的含量，馬弗爐灰化法測定灰分的含量。

1.3.3.1 水分含量測定

根據GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》[20]，采用直接干燥法進行測定。

1.3.3.2 灰分含量測定

根據GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》[21]方法進行測定。

1.3.3.3 蛋白含量測定

根據GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》[22]，采用半微量凱氏定氮法進行測定。

1.3.3.4 脂肪含量測定

1.3.3.5 多糖含量測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[24]。

1.3.3.6 粗纖維含量測定

根據GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》[25]，采用質量法進行測定。

1.3.4 鮐魚水溶性蛋白提取率的測定

水溶性蛋白提取率的測定采用Bradford法[26]。

1.3.4.1 牛血清蛋白標準曲線的制作

取11 支試管，編號為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，分別吸取牛血清蛋白標準液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，于10 mL具塞試管中，各管加水至1.0 mL，加入5.0 mL預冷的考馬斯亮藍G-250染色液，混勻后靜置2 min，以0號管作空白對照，測定各管595 nm波長處的吸光度，以吸光度為縱坐標，蛋白質量濃度為橫坐標作曲線，得到標準曲線方程。

1.3.4.2 水溶性蛋白提取率的測定

常愛蘭從上到下翻了三四張，就再也沒有翻下去了，這個三四張足夠她怒不可遏了。她不顧李老師在跟前，對準周小羽伸手就是一個響亮的耳光，沒等周小羽哭出聲來，她轉過身拾起一根棍子就劈頭蓋臉地朝周小羽打去。

取未知質量濃度的蛋白液（通過適當稀釋，使其質量濃度控制在0.01～0.1 mg/mL范圍內），加1 mL到試管內，再加入G-250染色液5 mL混勻，測其595 nm波長處的吸光度，同時做3 個平行實驗，根據標準曲線，求出未知蛋白液的質量濃度。

1.3.5 蛋白提取率的計算[27]

式中：X為樣品中蛋白提取率/%；V1為試劑消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積/mL；V2為試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積/mL；V3為吸取消化液的體積/mL；c為硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度/（mol/L）；m為試樣的質量/g；F為氮換算為蛋白的系數，計算采用6.25。

1.3.6 單因素試驗

1.3.6.1 料液比對水溶性蛋白提取率的影響

準確稱取10 g鮐魚，分別按料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）加入蒸餾水20、40、60、80、100 mL，調節pH值到7.0，在30℃條件的水浴鍋中保溫6 h，過濾，取濾液，濾渣重復提取2 次，將3 次濾液收集，利用考馬斯亮藍G-250法測定其水溶性蛋白提取率，進行3 次平行試驗。

1.3.6.2 提取溫度對水溶性蛋白提取率的影響

準確稱取10 g鮐魚，按料液比1∶6（g/mL）加入蒸餾水60 mL，調節pH值到7.0，分別在20、30、40、50、60 ℃條件的水浴鍋中保溫6 h，過濾，取濾液，濾渣重復提取2 次，將3 次濾液收集，利用考馬斯亮藍G-250法測定其水溶性蛋白提取率，進行3 次平行試驗。

1.3.6.3 提取時間對水溶性蛋白提取率的影響

準確稱取10 g鮐魚，按料液比1∶6（g/mL）加入蒸餾水60 mL，調節pH值到7.0，在30℃條件的水浴鍋中，分別保溫2、4、6、8、10 h，過濾，取濾液，濾渣重復提取2 次，將3 次濾液收集，利用考馬斯亮藍G-250法測定其水溶性蛋白提取率，進行3 次平行試驗。

1.3.6.4 提取次數對水溶性蛋白提取率的影響

準確稱取10 g鮐魚，按料液比1∶6（g/mL）加入蒸餾水，調節pH值到7.0，在30 ℃條件的水浴鍋中保溫6 h，過濾，取濾液，將濾渣分別進行重復提取1、2、3、4、5 次，將重復提取的濾液進行分別收集，利用考馬斯亮藍G-250法測定其水溶性蛋白提取率，進行3 次平行試驗。

1.3.7 響應面試驗

根據單因素試驗結果顯示的提取過程中各因素最佳水平，選取料液比、提取時間、提取溫度3 個對水溶性蛋白提取率影響較大的因素，在最佳水平附近選擇3 個水平，采用三因素三水平共17 個試驗點的響應分析試驗，零點試驗重復5 次，用以提高試驗誤差估計的靈敏度和準確度。采用Box-Behnken設計和響應面分析法優化水溶性蛋白的提取條件[28]。

1.3.8 鮐魚水溶性蛋白揮發性成分測定

1.3.8.1 固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）

將65 μm PDMS/DVB萃取頭于50 ℃條件下老化30 min。取5.0 mL樣品液，于15 mL頂空瓶中，立即旋蓋封口并固定于恒溫水浴鍋中，在設定溫度條件下加熱平衡30 min后將SPME針管穿透隔墊插入頂空瓶中，調整并固定在頂空瓶中的位置，推出已老化好的萃取頭以頂空方式萃取30 min，再將萃取頭縮回針管內并立即插入氣相色譜進樣口中，解吸10 min后取出萃取裝置。

1.3.8.2 檢測條件

氣相色譜條件：色譜柱VF-5MS氣相毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始溫度40℃，保持1.5 min后，以5.0 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；分流進樣，分流比1∶5，進樣口溫度250 ℃；載氣為高純度氦氣（99.999%），流速1 mL/min。質譜條件：電離源為電子轟擊離子源；離子阱溫度150 ℃；GC-MS傳輸線溫度280 ℃；電子轟擊離子源電子能量為70 eV；溶劑延遲時間2 min。

1.3.8.3 揮發性風味物質的鑒定

根據Willey譜圖庫對GC-MS分析鑒定的揮發性成分進行解析，將所有分析數據通過計算機檢索，并與有關文獻比較，再結合保留時間、質譜等參數和方法確定揮發性成分的化學組成。利用譜圖庫工作站數據處理系統按峰面積歸一化法，求得各化學成分在揮發性風味物質中的相對含量。

2 結果與分析

2.1 鮐魚水溶性蛋白營養成分分析

取鮐魚水溶液提取浸出物經凍干后的樣品，對其進行成分分析，結果表明：樣品水分含量為1.02%，灰分含量為5.20%，蛋白含量為75.06%，脂肪含量為4.60%，多糖含量為10.92%，粗纖維含量為3.20%。主要成分為蛋白，故以下簡稱為水溶性蛋白，進行成分分析得到水溶性蛋白經凍干后，呈淡黃色或黃色粉末，蓬松柔軟，易吸濕，易溶于水，水溶液性質穩定，略有魚香味。

2.2 鮐魚水溶性蛋白的提取條件優化

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 料液比對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響

圖 1 料液比對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of material-to-solvent ratio on the yield of water-soluble protein

由圖1可知，隨著溶劑用量增大，水溶性蛋白提取率也隨之增大；但在料液比1∶6之后，溶劑用量增加使提取率減小，溶劑用量過大會造成溶劑和能源的浪費，且會給濃縮過程帶來負擔，所以確定料液比為1∶6。

2.2.1.2 提取溫度對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響

圖 2 提取溫度對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of water-soluble protein

提取溫度是影響提取效率的重要因素之一。隨著提取溫度的升高，鮐魚水溶性蛋白獲得相對高的提取率，原因可能是高溫溶劑容易促進細胞壁上的多糖物質分散到溶劑體系，弱化或者破環細胞壁的完整性，使得溶劑更加容易和水溶性蛋白接觸，從而提高提取率。但是溫度過高，提取率反而下降，可能是由于溫度過高，使得蛋白變性，因而提取率下降。

由圖2可知，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率也隨之增大；但溫度升高到30 ℃之后，再繼續上升，水溶性蛋白提取率反而下降，這可能是由于蛋白的結構被破壞，特別是水溶性蛋白中的活性蛋白。

2.2.1.3 提取時間對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響

提取時間越長，溶劑越能夠充分滲透到鮐魚組織的各個部位，與蛋白物質充分接觸并溶解，從而可以提高提取率，但是提取時間過長，可能會引起水溶性蛋白的變性。

圖 3 提取時間對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the yield of water-soluble protein

由圖3可知，隨著提取時間的延長，水溶性蛋白提取率不斷提高，但3 h之后，提取率呈現微下降趨勢，因此確定提取時間為3 h。

2.2.1.4 提取次數對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響

圖 4 提取次數對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of extraction number on the yield of water-soluble protein

多次浸提可以提高鮐魚中水溶性蛋白的提取率。由圖4可知，水溶性蛋白提取率隨著提取次數的增加而增加，3 次浸提的蛋白提取率顯著高于2 次浸提的蛋白提取率，但4 次浸提的蛋白提取率與3 次浸提的蛋白提取率沒有明顯差異，故選用3 次浸提作為最終提取方案。

2.2.2 響應面試驗優化鮐魚水溶性蛋白的提取條件

2.2.2.1 響應面試驗設計與結果

鮐魚水溶性蛋白的提取受到很多因素的影響，而且各個因素之間往往又相互影響相互作用，根據Box-Behnken試驗設計原理，以3 個重要影響因素料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，以水溶性蛋白提取率為響應值，進行三因素三水平試驗，將17個試驗點的響應值進行回歸分析，響應面分析試驗設計與結果見表1。

表 1 鮐魚水溶性蛋白提取響應面分析方案及結果Table 1 Experimental scheme and results for reponse surface methodology

對試驗結果進行回歸分析，以鮐魚水溶性蛋白提取率為響應值，經回歸擬和后，各試驗因素對響應值的影響可通過如下回歸方程表示：提取率/%=74.80＋3.55A-5.20B-3.85C-3.13AB＋1.83AC＋2.43BC-6.49A2-14.34B2-12.24C2。

2.2.2.2 模型方差分析

對模型進行方差分析，用模型對水溶性蛋白提取率進行分析和預測，探討3 個因素對蛋白提取的影響，結果見表2。

表 2 鮐魚水溶性蛋白提取回歸方程的方差分析結果Table 2 Analysis of variance of regression equation

由表2可知，對水溶性蛋白提取率所建立的回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），該模型的復相關系數R2為0.988 5，表明該模型與實際情況擬合較好。在所選的各因素水平范圍內，各因素對水溶性蛋白提取率的影響順序為：提取溫度＞提取時間＞料液比。表2顯示，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對水溶性蛋白提取率的影響極為顯著（P＜0.01），交互項AB、BC對水溶性蛋白提取率的影響為顯著（P＜0.05），交互項AC對水溶性蛋白提取率的影響不顯著。

2.2.2.3 鮐魚水溶性蛋白提取因素間的交互作用

響應面分析見圖5～7。響應面三維圖能直觀地反映出各因素對響應值的影響程度及因素間交互作用的強弱。三維圖在平面上的投影即為等高線圖，等高線形狀反映了交互影響的強弱，圓形等高線表明兩因素的交互作用相對較弱；橢圓形等高線兩因素的交互作用相對較強[29]。

圖 5 料液比與提取溫度對鮐魚水溶性蛋白提取率的交互影響Fig.5 Effects of material-to-solvent ratio and extraction temperature on the yield of water-soluble protein

圖 6 料液比與提取時間對鮐魚水溶性蛋白提取率的交互影響Fig.6 Effects of material-to-solvent ratio and extraction time on the yield of water-soluble protein

圖 7 提取時間與提取溫度對鮐魚水溶性蛋白提取率的交互影響Fig.7 Effects of extraction time and temperature on the yield of water-soluble protein

從圖5可以看出，當料液比一定時，提取溫度對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響比較小，但是當提取溫度一定時，水溶性蛋白提取率隨溶劑用量的增大先增大后減少。從圖6可以看出，在料液比一定時，隨著提取時間的延長，水溶性蛋白的提取率先是逐漸增大，當達一定的提取時間時，水溶性蛋白提取率又開始逐漸減小。但是當提取時間一定時，水溶性蛋白提取率隨溶劑用量的增大先升高后降低。從圖7可以看出，當提取時間一定時，提取溫度對鮐魚水溶性蛋白提取率的影響比較小。但當提取溫度一定時，隨著提取時間的延長水溶性蛋白提取率先增大后減小。分析其原因可能是由于蛋白變性，發生凝集，實驗測得水溶性蛋白的量減少。

根據軟件分析結果結合實際得最優化提取條件為料液比1∶6.612、提取溫度27.73℃、提取時間3.84 h，提取的水溶性蛋白提取率為76.24%。為了驗證模型的有效性，固定提取條件在優化條件下進行驗證實驗。料液比1∶6.6、提取溫度27.7 ℃、提取時間3.8 h，實驗結果顯示，水溶性蛋白提取率為76.12%。驗證實驗的實測值與預測值非常接近。

2.3 鮐魚水溶性蛋白揮發性成分分析

2.3.1 鮐魚水溶性蛋白揮發性成分的GC-MS總離子色譜圖

表 3 鮐魚水溶性蛋白的揮發性成分的GC-MS 分析Table 3 Volatile compounds identified from mackerel meat, water-soluble protein extract and extraction residue

圖 8 鮐魚水溶解前后揮發性物質的GC-MS分析總離子色譜圖Fig.8 GC-MS chromatograms of volatile compounds of mackerel meat, water-soluble protein extract and extraction residue

將鮐魚進行水溶性蛋白提取，并分別對原料鮐魚、水溶性蛋白溶液、提取水溶性蛋白后的鮐魚魚塊進行GC-MS分析，得到的總離子流色譜圖如圖8所示。

2.3.2 鮐魚水溶性蛋白的揮發性成分鑒定

對總離子色譜圖進行分析表明，水溶解后的樣品揮發性成分發生了變化。通過計算機標準質譜圖庫檢索、各組分的質譜圖分析及與文獻報道的質譜數據分析，并通過歸一化定量，其結果見表3。

表3結果表明，原料鮐魚在26.569 min產生的丁香碳醛，水溶解后不再含有。鮐魚原料中含有的苯甲醛進入溶液中，水溶解后的鮐魚魚肉中也不再含有；而且，在14.582 min產生了（E,E）-2,4-壬二烯醛。16.643 min產生了順-5-辛烯-1-醇。17.718 min產生了（3E,5E）-3,5-辛二烯-2-酮。23.870 min產生了2-癸炔-1-醇。26.514 min產生了異胡薄荷醇。水溶解后的溶液中產生了2 種新物質，分別是在26.507 min產生了丁香醛A，在27.975 min產生了2-壬烯-4-酮-1,2-甲基。

原料鮐魚共含有23 種揮發性成分，其中醇類有10 種，醛類有5 種，呋喃類3 種，酮類占3 種，烷烴、芳香烴各1 種，相對含量分別為醇類占85.28%，醛類含量占6.97%，呋喃含量占4.09%，酮類含量占0.16%，烷烴、芳香烴含量占3.50%。

提取水溶性蛋白后的鮐魚魚塊含揮發性成分26 種，其中主要的揮發性風味物質仍為醇類，共含有13種，另外，還含有酮類4 種，醛類4 種，呋喃3 種，烷烴、芳香烴2 種，新產生3 種醇類，1 種酮類，1 種醛類。醇類含量有所下降，為79.65%，酮類含量有了提高，為7.52%，呋喃類、醛類、烴類含量都沒有明顯變化，分別為3.81%，醛類為5.53%，烷烴、芳香烴為3.49%。

水溶性蛋白溶液中揮發性成分物質種類較少，為21 種，其中醇類9 種，醛類4 種，呋喃3 種，酮類3 種，烷烴、芳香烴各1 種。含量醇類為64.97%，醛類為13.59%，呋喃類為10.00%，酮類為10.30%，烷烴、芳香烴為1.14%。

3 結 論

鮐魚水溶性蛋白的最佳提取工藝條件為料液比1∶6.6、提取溫度27.7 ℃、提取時間3.8 h，提取的水溶性蛋白提取率為76.12%。將鮐魚原料和水溶解后樣品的揮發性成分進行分析，結果表明，水溶性蛋白揮發性成分醇類物質含量降低，酮類、醛類、呋喃類物質含量都有了明顯提高。樣品經過冷凍干燥后，呈淡黃色或黃色粉末，蓬松柔軟，易吸濕，易溶于水，水溶液性質穩定，略有魚香味。

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Extraction and Volatile Components of Mackerel Water-Soluble Proteins

ZHOU Jiaping1, ZHANG Wentao2, MENG Meng2, WANG Yuemeng2, LIU Anjun2, ZHENG Jie2
(1. Research Center for Modern Analysis Techniques, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China；2. College of Food and Biotechnology, Tianjin University of Science and Te chnology, Tianjin 300457, China)

By using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology, the optimal conditions for the extraction of water-soluble proteins from mackerel meat were determined as solid-liquid ratio of 1:6.6, extraction temperature of 27.7 ℃, and extraction time of 3.8 h. Experiments conducted under these conditions led to an extraction yield of 76.12%. Solid phase microextraction combined with GC-MS was used to analyze the volatile components of mackerel meat and the protein extract. The results showed that the content of alcohols decreased, whereas the contents of ketones, aldehydes, and furans in the extract markedly increased as compared to mackerel meat. The water-soluble proteins after freeze-drying were light yellow or yellow, fluffy and soft, could easily absorb moisture, and had good solubility and stability in water with a slight fishy flavor.

mackerel； water-soluble proteins； gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS254

A

1002-6630（2015）08-0012-07

10.7506/spkx1002-6630-201508003

2014-07-03

國家自然科學基金青年科學基金項目（30471225）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102204）

周家萍（1987—），女，助理實驗師，碩士，研究方向為營養與食品衛生。E-mail：zhoujiaping@tust.edu.cn