響應面法優化蓮子磨皮粉中蛋白質的提取工藝

賀 偉，劉永樂*，王發祥

響應面法優化蓮子磨皮粉中蛋白質的提取工藝

賀 偉，劉永樂*，王發祥

（長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410 114）

磨皮粉是紅蓮子加工時機械磨皮的副產物，不僅產量很大，而且營養成分豐富，若不綜合利用會導致嚴重的資源浪費。通過Plackett-Burman試驗→最陡爬坡試驗→響應面試驗的模式設計方法，考察溫度、時間等因素對磨皮粉蛋白質提取率的影響，獲得磨皮粉蛋白質提取的最優條件是Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1（mL/g）、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min，此時蛋白質提取率達93.38%。

蓮子；蓮子磨皮粉；蛋白質；響應面法

蓮子是我國特有的種質資源，屬睡蓮科多年水生草本植物蓮的成熟種子。我國蓮子種植面積150多萬畝，主要集中在湖南、湖北、江蘇、浙江、江西、福建等地區省市[1-5]。蓮子自古以來就是我國及東亞、東南亞人民所喜愛的珍貴營品，其味道清香，營養豐富，滋補療效顯著，而且蛋白質、維生素、糖及鈣、磷等多種人體必需的基礎營養物質含量也較高[6-12]。因此，蓮子相關產品深受消費者喜愛，市場前景廣闊，蓮子的加工率和加工水平也在逐年提高。

在干蓮子加工過程中，為避免相關產品的外觀和口感受到影響，常常需要經過機械處理去掉蓮子表面棕紅色的種皮，機械磨皮過程會產生約占蓮子總質量1/5的蓮子磨皮粉，其不僅產量巨大，而且營養豐富，其中蛋白質含量為18%～19%，淀粉含量更是高達40.00%。然而，在實際生產中，磨皮粉大多成了低值廢棄物，主要用于生產飼料甚至直接扔掉，造成了嚴重的資源浪費和環境污染[13-14]。因此研究蓮子磨皮粉的高值化利用技術，對提高蓮子的綜合價值和保護環境都有著重要的實際意義。

近年來，蓮子磨皮粉的綜合利用開始受到關注，研究人員也開展了一些相關的研究，如陳軒等[15]對蓮子皮的化學成分進行了初步分析，徐虹等[16-17]采用微波鹽提法優化了蓮子皮蛋白質提取工藝，但研究仍不夠深入。本研究創新采用Na2CO3-NaHCO3緩沖液[18]代替傳統的鹽或堿提取液，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、響應面試驗優化磨皮粉蛋白質提取條件，為將蓮子磨皮粉用于生產蓮子蛋白粉或其他含蓮蛋白食品及實現蓮子磨皮粉的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子磨皮粉由湖南粒粒珍湘蓮有限公司提供。

無水Na2CO3、NaHCO3、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純。

1.2 儀器與設備

ATN-300全自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設備有限公司；BL-620S島津電子天平 日本島津公司；LG10-2.4A型高速離心機 北京京立離心機有限公司；高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮子磨皮粉的制備

蓮子磨皮粉經高速粉碎機粉碎后過80 目篩，分裝，置于干燥器中備用。

1.3.2 蛋白質含量及提取率的測定

參考GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》[19]，測定磨皮粉中蛋白質含量。準確稱取一定量的磨皮粉，在一定條件下提取蛋白質后離心，將上液定容至100 mL，再取5 mL進行消化，以凱氏定氮法測定提取液中的蛋白質含量。按下式計算蛋白質提取率。

1.3.3 提取液的篩選

分別以蒸餾水、0.5 mol/L NaCl溶液、0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.15）、0.2 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 7.0）對蓮子磨皮粉的蛋白質進行提取，以蛋白質提取率為指標，選擇合適的提取液。

1.3.4 Plackett-Burman篩選顯著因子

根據經驗及前期實驗摸索，選取Na2CO3-NaHCO3緩沖液作為蛋白質提取劑，對緩沖液濃度、pH值、液固比、提取溫度、提取時間、超聲時間、攪拌間隔時間這7 個影響蛋白質提取效果的因素進行考察，以蓮子磨皮粉蛋白質提取率為響應值，根據試驗結果對因素進行顯著性評價（P＜0.05），篩選出顯著性因子。試驗因素及水平見表1。

表 1 Plaekett-Burman試驗因素及水平Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.5 最陡爬坡試驗確定中心點

根據Plackett-Burman試驗結果，選取Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度、液固比、pH值3 個顯著因素進行最陡爬坡試驗，其他各因素則根據效應系數正負選擇相應的水平，從而快速地接近最大響應區域。

1.3.6 Box-Behnken試驗設計

以最陡爬坡試驗確定的提取率響應值最大的條件為中心點，以Design-Expert 8.0.5b軟件進行Box-Behnken試驗設計，試驗因素與水平見表2。

表 2 Box-Behnken試驗因素水平Table 2 Factors and levels used in Box-Benhnken design

2 結果與分析

2.1 最佳提取液選擇結果

表 3 不同提取液提取效果Table 3 Effect of different extract solvents on the extraction efficiency of protein

采用不同提取液對蓮子磨皮粉蛋白質進行提取，結果如表3所示。根據提取率的結果可知，0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.15）對磨皮粉蛋白質的提取率最高，以其為最佳提取液，進行下一步實驗。

2.2 Plackett-Burman試驗結果

表 4 Plaekett-Burman試驗設計與結果Table 4 Plackett-Burman design and experimental resultsTable 4 Plackett-Burman design and experimental results

Plackett-Burman法是一種近飽和的二水平試驗設計方法。它能用最少試驗次數估計出因素的主效應，以便快速有效地從眾多考察因素中篩選出最為重要的幾個因素供進行下一步研究[20-23]。采用N=12的Plackett-Burman試驗設計，結果如表4所示。

表 5 Plackett-Burman試驗結果的估計效應和系數Table 5 Analysis of variance (AVONA) of Plackett-Burman experimental results

圖 1 標準化效應的Pareto圖（響應為提取率，α=0.01，臨界值2.920）Fig.1 Pareto chart of the standardized effects (response for the extraction yield, α = 0.01)

用Minitab 16軟件對表4中的Plackett-Burman試驗結果進行分析，得到各因素的方差分析結果（表5）以及標準化效應的Pareto圖（圖1）。經分析可知Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度、提取溫度、攪拌間隔時間對磨皮粉蛋白質提取率顯示出負效應，而pH值、液固比、提取時間、超聲時間顯示為正效應。標準化效應的Pareto圖則顯示在90%的置信水平內，液固比、Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度以及pH值的效應最大，對提取率響應值影響顯著。

2.3 最陡爬坡試驗結果

最陡爬坡試驗是一種通過連續增加或減少顯著因素的試驗值以使響應值快速逼近最佳值區域的程序，其爬坡的方向由各因素效應系數的正負決定，變化步長則根據經驗及相關效應值的大小來確定。最陡爬坡試驗確定的顯著因素的變化幅度分別為Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.01 mol/L、pH 0.2、液固比2∶1，提取時間和攪拌間隔時間取Plackett-Burman試驗時的高水平，其余因素取值Plackett-Burman試驗時的低水平。分析最陡爬坡試驗結果（表6）可知：0＋3Δ號試驗組的提取率響應值達93.30%，為最大值，之后響應值開始下降。選取此試驗條件作為Box-Behnken響應面設計的中心點。

表 6 最陡爬坡試驗設計及結果Table 6 Steepest ascent design and experimental results

2.4 Box-Behnken試驗結果

表 7 Box-Behnken試驗設計及結果Table 7 Box-Behnken design and experimental resultsTable 7 Box-Behnken design and experimental results

表 8 Box-Behnken試驗結果方差分析Table 8 ANOVA of Box-Behnken experimental results

響應面試驗的設計及結果分析見表7。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對試驗結果進行二次多元回歸擬合[24-26]，編碼回歸方程Y=92.81＋0.73A-0.82B＋0.72C-0.062AB＋0.38AC-0.59BC-2.84A2-2.90B2-0.12C2，而實際因素的回歸方程為：蓮子磨皮粉蛋白質提取率=-360.067 42＋16.437 50A＋33.196 25B＋29.292 19C-1.562 50AB＋46.875 00AC-0.737 50BC-7090.625 00A2-0.725 31B2-0.773 44C2，為了驗證模型的有效性，進行了方差分析（表8）。如表8所示，A、B、A2、B2為顯著性影響因素，其他變量的影響均不顯著（P＞0.05）。該回歸模型的P值為0.005 4（小于0.01），即模型顯著擬合程度好。同時失擬項P值為0.313 4（大于0.05），即失擬項不顯著，說明該響應面能夠較真實地反映試驗結果，有實際應用意義，可用此模型對蓮子磨皮粉蛋白質的提取效果進行分析預測。

圖 2 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度和液固比對提取率的影響Fig.2 Effect of Na2CO3-NaHCO3concentration and solvent-to-solid ratio on the extraction efficiency of protein

圖 3 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度和pH值對提取率的影響Fig.3 Effect of Na2CO3-NaHCO3concentration and pH on the extraction efficiency of protein

圖 4 液固比和pH值對提取率的影響Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio and pH on the extraction efficiency of protein

從圖2 Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度與液固比的交互作用顯示，在液固比17∶1～18∶1、Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.02～0.04 mol/L范圍內，蓮子磨皮粉蛋白質提取率響應值可達最佳區域。且提取率隨著液固比及Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度的增加先升高后降低。圖3和圖4顯示蓮子磨皮粉蛋白質提取率隨pH值的升高而增大，但是幅度不大。從以上3個圖可知提取液濃度和液固比對應的曲面比較陡峭，說明這兩個因素相對結果影響顯著，這與方差分析的結果一致。結合響應面及等高線圖可知，蓮子磨皮粉蛋白質提取率的最佳取值范圍位于Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.02～0.04 mol/L、液固比17∶1～18∶1、pH 10.1～10.5。為了進一步確定變量的最佳取值點，通過Design-Expert 8.0.5b軟件的Optimization功能，計算得到蛋白質提取率有最大響應值時3 個因素的取值，即Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03mol/L、液固比17.51∶1、pH 10.5，該條件預測條件下的蓮子磨皮粉蛋白質提取率為93.687 7%。

在修正后的最優條件Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min條件下進行3 次驗證實驗，測得蛋白質的提取率為93.38%，比預測值略低，說明用該回歸方程分析所獲得的優化提取條件是可信的。

3 結 論

通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、響應面試驗獲得磨皮粉蛋白質提取的最優條件是Na2CO3-NaHCO3緩沖液濃度0.03 mol/L、液固比17.5∶1、pH 10.5、提取溫度20 ℃、提取時間1 h、攪拌間隔時間10 min、超聲時間7.5 min，此時蛋白質提取率可達93.38%。

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Optimization of Extraction Process for Peel Waste Protein from Lotus Seeds by Response Surface Methodology

HE Wei, LIU Yongle*, WANG Faxiang
(College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

A large amount of red lotus peel waste, which contains abundant nutrients, is produced during mechanical peeling of red lotus seeds. Accordingly, insufficient utilization of this byproduct is a serious waste of resource. The present study examined the impact of various factors on the extraction efficiency of protein from lotus seed peel waste by the combined use of Plackett-Burman design, steepest ascent design and response surface methodology. We found that 0.03 mol/L Na2CO3-NaHCO3buffer solution at pH 10.5 was the best solvent for the extraction of lotus seed peel waste protein. A solvent-to-solid ratio of 17.5:1, an extraction temperature of 20 ℃ and 1 h extraction proved optimal, resulting in an extraction yield of 93.38%.

lotus seed； peel waste； protein； response surface analysis

TS201.6；TS207.4

A

1002-6630（2015）08-0024-05

10.7506/spkx1002-6630-201508005

2014-09-26

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B08）

賀偉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為大宗農產品加工技術。E-mail：583346178@qq.com

*通信作者：劉永樂（1962—），男，教授，博士，研究方向為大宗農產品加工技術。E-mail：1y1e19@163.com