桑葉經霜前后次生代謝產物表達差異分析

張魏琬麒，歐陽臻*，趙 明，魏 淵，邵 揚，王志萬，汪 強

桑葉經霜前后次生代謝產物表達差異分析

張魏琬麒，歐陽臻*，趙 明，魏 淵，邵 揚，王志萬，汪 強

（江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013）

為研究桑葉經霜采收的合理性，采用高效液相色譜-質譜法分析桑葉中黃酮類成分，并建立高效液相色譜法同時分析綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷4 個成分含量及柱前衍生化-高效液相色譜熒光檢測法分析桑葉1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）含量，研究不同季節黃酮類成分、4 個單體成分及生物堿（DNJ）動態變化規律。結果表明，桑葉黃酮類成分在7、8月份氣溫較高時含量較低，10、11月份經霜后達最大值；DNJ在7、8月份氣溫較高時含量最高，9、10月份隨著氣溫下降含量下降，經霜后更低。生物堿類成分對桑葉疏散風熱、清熱潤肺等功效可能影響較小，桑葉經霜藥用可能與黃酮類成分有關。

桑葉；次生代謝產物；高效液相色譜-質譜法；經霜；動態變化

桑葉始載于《神農本草經》，為桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥葉，性寒、味甘苦，歸肺、肝經，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目之功效，常用于風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花等[1]。古代就有用來“止消渴”和“明目長發”。現代藥理研究認為桑葉具有降糖、降脂、抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗炎等生物活性，其活性成分主要為黃酮類、生物堿類、苯丙素類、甾體及三萜類等次生代謝產物[2-5]。桑葉營養豐富，被國家衛生部列入“既是食品又是藥品”名單，在功能性食品領域研究開發中也具有廣闊前景[6]。中醫歷來認為冬桑葉、霜桑葉具有上乘品質，古代眾多醫藥典籍中的桑葉也多為經霜后采收，歷版《中國藥典》中收錄的桑葉藥材也為“霜桑葉”。桑葉為何經霜后采收？藥用植物在生長發育不同時期，次生代謝產物具有高度動態性[7-8]，次生代謝產物通常是中藥的主要功效成分，因此植物內源性次生代謝產物動態變化及規律是研究植物功效物質的重要途徑[9-10]。對不同生長季節桑葉中生物堿、黃酮、蘆丁、1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）等的含量變化已有一些文獻[11-12]報道，本課題組前期也對不同季節桑葉中DNJ、蘆丁和多糖等成分的動態變化進行了研究[13-15]，但現有研究結果對于桑葉經霜采收的科學性與合理性尚不能科學闡釋，僅選取1 種或2 種成分作為指標難以全面地反映桑葉次生代謝產物的動態變化規律以及經霜對其品質的影響。本研究采用高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法對桑葉中黃酮類成分進行分析，并建立HPLC同時測定桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸含量的方法，分析不同生長季節桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸含量；采用柱前衍生化-高效液相色譜熒光檢測法[16]分析不同生長季節桑葉中生物堿（DNJ）含量，對桑葉不同生長季節和霜降前后主要次生代謝產物表達差異進行分析，為進一步闡明桑葉經霜采收的合理性及不同用途合理采收提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：2013年4—12月（10月23日為霜降）采自江蘇大學桑樹種植園。經江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為桑科植物桑的葉，低溫干燥粉碎后（過40 目篩）備用。

蘆丁（批號：100080-200707）、異槲皮苷（批號：111809-201001）、紫云英苷（批號：11092001）、綠原酸（批號：110753-200413） 中國食品藥品檢定研究院；DNJ對照品（批號：20120508） 上海原葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國默克公司；芴甲氧酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-Cl）美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JASCO LC1500高效液相色譜系統 日本分光公司；N2000色譜工作站 浙江大學信息智能研究所；LC 2000液相色譜儀 美國安捷倫公司；LXQ線性離子阱質譜 賽默飛世爾科技公司；R-200 旋轉蒸發儀 德國Büchi公司；AE240分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHB-111循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；HHS-1恒溫水浴鍋 上海浦東躍新科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

1.3.1.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取蘆丁1.3 mg、異槲皮苷1.5 mg、紫云英苷0.9 mg、綠原酸1.0 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，即得混合對照品儲備液（蘆丁260.0 μg/mL、異槲皮苷300.0 μg/mL、紫云英苷180.0 μg/mL、綠原酸200.0 μg/mL）。精密吸取混合對照品儲備液1 mL，逐級稀釋，得一系列不同質量濃度的混合對照品溶液，備用。

1.3.1.2 DNJ對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒質量的DNJ對照品1.52 mg，置10 mL容量瓶中，蒸餾水定容制得質量濃度為152 μg/mL的DNJ對照品母液。用蒸餾水將152 μg/mL的DNJ對照品母液稀釋成76、38、19、9.5 μg/mL的對照品溶液系列，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備

1.3.2.1 桑葉黃酮類成分供試品溶液的制備

精密稱取1 g干燥至恒質量的桑葉粉末，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，藥渣再同法提取2 次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘渣用甲醇溶解并轉移至50 mL容量瓶，甲醇定容。以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

1.3.2.2 DNJ供試品溶液的制備[16]

精密稱取0.2 g干燥的桑葉粉末，置于10 mL的離心管中，加入10 mL 0.05 mol/L鹽酸溶液，渦旋提取30 s后離心15 min，取上清液，藥渣再次加10 mL 0.05 mol/L鹽酸溶液，同法重復提取1 次，合并2 次提取液，轉移至50 mL容量瓶，加蒸餾水定容。

衍生化過程：取待測樣品溶液10 μL置1.5 mL離心管中，加入硼酸緩沖溶液（pH 8.5）10 μL，加入5 mmol/L FMOC-Cl的衍生化試劑20 μL，混勻后水浴20 ℃反應20 min后，加入10 μL 0.1 mol/L甘氨酸溶液，最后加入950 μL體積分數0.1%醋酸溶液。混勻后以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

1.3.3 色譜及質譜條件

1.3.3.1 黃酮類成分色譜條件

色譜柱：KromasilC18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、ODS3預柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；HPLC-MS定性分析：流動相為乙腈（A）-0.8%醋酸水溶液（B）；HPLC定量分析：流動相為乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B）；均為梯度洗脫：0～5 min為11%A，5～10 min為11%～13.5%A，10～17 min為13.5%A，17～19 min為13.5%～19%A，19～33 min為19%～20%A，33～40 min為20%～30%A；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器檢測波長358 nm；進樣量20 μL。

1.3.3.2 質譜條件

電噴霧離子源，負離子模式；鞘氣流速10.5 L/min；輔助氣1.5 L/min；噴霧電壓4.5 kV；毛細管溫度325.00 ℃；毛細管電壓-30.00 V；透鏡電壓-120.00 V；質量掃描范圍m/z 100.00～1 200.00。

1.3.3.3 生物堿類成分（DNJ）色譜條件

色譜柱：HiQSiLC18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸（50∶50，V/V）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；熒光檢測器激發波長254 nm、發射波長322 nm；進樣量10 μL。

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 精密度實驗

精密吸取同一混合對照品溶液20 μL，按1.3.3.1節色譜條件重復測定6 次，記錄峰面積。精密吸取同一DNJ對照品溶液10 μL，按1.3.3.3節色譜條件重復測定6 次，記錄峰面積，計算峰面積的相對標準偏差（relative sandard deviation，RSD），考察儀器的精密度。

1.3.4.2 重復性實驗

分別取同一桑葉樣品1 g共6 份，精密稱定，按1.3.2.1節方法制備供試品溶液，按1.3.3.1節方法測定，記錄峰面積。分別取同一桑葉樣品0.2 g共6 份，精密稱定，按1.3.2.2節方法制備供試品溶液，按1.3.3.3節方法測定，記錄峰面積，計算RSD，考察其重復性。

1.3.4.3 穩定性實驗

取同一黃酮供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h不同時間點進樣測定，記錄峰面積。取同一DNJ供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h不同時間點進樣測定，記錄峰面積，計算RSD，考察其穩定性。

1.3.4.4 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的桑葉樣品共6 份，分別精密加入蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸對照品溶液適量，按1.3.2.1節方法制備供試品溶液，按1.3.3.1節方法測定，由回歸方程計算樣品中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量。

精密稱取已知含量的桑葉樣品共6 份，分別加入DNJ對照品溶液適量，按1.3.2.2節方法制備供試品溶液，按

1.3.3.3 節方法測定，由回歸方程計算DNJ的含量。

1.3.5 不同生長季節桑葉中各次生代謝產物含量測定

將不同季節桑葉樣品按1.3.2.1、1.3.2.2節方法制備成供試品溶液，按1.3.3.1、1.3.3.3節色譜條件進樣分析，由回歸方程計算樣品中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、DNJ各種成分含量。

1.3.6 氣溫與黃酮類成分、生物堿類成分含量間的相關性分析

以每日的平均氣溫作圖，得不同日期平均氣溫的變化趨勢圖。采用SPSS 20.0軟件進行平均氣溫與蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸、DNJ含量的相關性分析，考察氣候溫度對桑葉中各次生代謝產物表達的影響。

2 結果與分析

2.1 桑葉中黃酮類成分的HPLC-MS定性分析

桑葉樣品的HPLC圖和HPLC-MS總離子流圖見圖1。根據質譜提供的一級、二級離子碎片數據并參照相關文獻[17-19]，對圖譜中峰面積較大的8 個峰進行峰歸屬的分析，其中峰3、峰4、峰5與峰7與標準品對照保留時間得到確認。結果見表1。

圖 1 桑葉樣品HPLC圖（A）及總離子流圖（B）Fig.1 HPLC chromatogram and LC-MS total ion current chromatogram of mulberry leaf extract

表 1 HPLC-MS定性分析黃酮類成分結果Table 1 Qualitative analysis of flavonoids in mulberry leaves by HPLC-MS

2.2 HPLC法同時測定綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量

2.2.1 黃酮類成分HPLC測定

按1.3.3.1節色譜條件對桑葉樣品進行分析，記錄色譜圖2。在該條件下，4 種指標性成分在樣品中得到很好的分離，峰形較好。

圖 2 混合對照品（A）和桑葉樣品（B）HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and real sample (B)

2.2.2 標準曲線和線性范圍考察

分別取不同質量濃度的對照品溶液，按1.3.4節進樣測定。以對照品質量濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，結果見表2。

表 2 綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的線性回歸關系考察Table 2 Linear equations of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin and astragalin

2.2.3 精密度

綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷峰面積的RSD分別為1.7%、1.5%、1.7%、1.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性

綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷峰面積的RSD分別為1.9%、1.2%、1.8%、2.0%，表明方法重復性良好。

2.2.5 穩定性

綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷峰面積的RSD分別為1.7%、1.5%、2.1%、2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性較好。

2.2.6 加樣回收率

綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的平均回收率分別為97.5%（RSD為1.8%）、99.7%（RSD為2.1%）、97.8%（RSD為2.1%）、98.4%（RSD為2.3%），表明該方法的加樣回收效果較好。

2.2.7 不同生長季節桑葉中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含量

表 3 不同生長季節桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸和DNJ含量（n=3）Table 3 The contents of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, astragalin and DNJ in mulberry leaves in different growth seasons (n=3) mg/g

按1.3.5節方法測定不同生長季節桑葉中次生代謝產物綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷4 種成分含量，結果見表3。由表3可知，桑葉黃酮類成分在不同生長季節含量呈動態變化，綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷4 個單體成分變化規律基本一致。四者含量在4、5月份較高，在8、9月份當氣溫較高時含量卻顯著下降，之后含量隨氣溫下降又逐漸升高，11月份經霜后含量達最高，蘆丁達0.72 mg/g，異槲皮苷達1.16 mg/g、紫云英苷達0.77 mg/g、綠原酸達1.39 mg/g，12月份之后自然脫落的枯桑葉含量最低，蘆丁為0.25 mg/g、異槲皮苷為0.32 mg/g、紫云英苷為0.31 mg/g、綠原酸為0.24 mg/g。

2.3 柱前衍生化-HPLC-熒光檢測法測定生物堿類成分（DNJ）含量結果

2.3.1 生物堿類成分（DNJ）HPLC測定

圖 3 DNJ對照品（A）和桑葉樣品（B）HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of DNJ reference substances (A) and real sample (B)

按1.3.3.3節色譜條件對桑葉中DNJ進行分析，記錄色譜圖。從圖3可以看出，樣品中的DNJ與相鄰組分均得到良好的基線分離，試劑的水解副產物FMOC-OH和Gly-FMOC均不干擾組分的測定。

2.3.2 標準曲線和線性范圍考察

分別取10 μL對照品溶液，按1.3.2.2節衍生化步驟衍生和1.3.3.3節液相色譜分析。以峰面積為縱坐標，對照品溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得DNJ的回歸方程為：Y=37 026.8X-42 091.4（r=0.999 9），結果表明DNJ在9.5～152 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.3 方法學考察

精密度實驗DNJ峰面積的RSD為1.8%，重復性實驗DNJ峰面積的RSD為2.0%，穩定性實驗DNJ峰面積的RSD為1.8%，DNJ的平均回收率為98.3%（RSD為1.5%），RSD均小于2.0%。表明方法可靠。

2.3.4 不同生長季節桑葉DNJ含量

按1.3.5節方法測定不同生長季節桑葉樣品中生物堿類成分（DNJ）含量，結果見表3。由表3可知，不同生長季節的桑葉中生物堿類成分（DNJ）含量動態變化與黃酮類成分相反，見圖4。4月份氣溫較低時，DNJ含量較低，為0.69 mg/g，5月份隨著氣溫逐漸升高，含量逐漸升高，7、8月份含量最高，達到2.88 mg/g，從9、10月份隨著溫度降低含量持續下降，11月份經霜后含量更低，12月份桑葉自然脫落，含量僅為0.35 mg/g。

圖 4 不同生長季節桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸和DNJ含量動態變化圖Fig.4 Dynamic changes in the contents of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, astragalin and DNJ in mulberry leaves in different growth seasons

2.4 氣溫與黃酮類成分、生物堿類成分含量間的相關性分析

圖 5 不同日期平均氣溫變化圖Fig.5 The average temperatures at different dates

表 4 平均氣溫與蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸、DNJ含量間的相關性Table 4 Correlation between average temperature and the contents of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, astragalin and DNJ

不同日期平均氣溫的變化趨勢見圖5，結合圖4。按1.3.6節方法采用SPSS 20.0進行平均氣溫與桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、綠原酸、DNJ含量的相關性分析，結果見表4。由表4可知，平均氣溫與黃酮類成分含量呈負相關，與蘆丁相關系數為-0.389（P＜0.05），與異槲皮苷相關系數為-0.180，與紫云英苷相關系數為-0.394（P＜0.05），與綠原酸相關系數為-0.507（P＜0.01），與4 個單體成分總和的相關系數為-0.467。平均氣溫與DNJ含量呈極顯著正相關，相關系數為0.882（P＜0.01）。

3 討 論

本研究先采用HPLC-MS對桑葉進行定性分析，然后選擇其中4 種主要的已知成分（綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷），進行HPLC定量分析，綠原酸屬于苯丙素類物質，蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷屬于黃酮類物質，但其均屬于多酚類成分[20]，且結構中均含苯環和酚羥基，故能在同一流動相條件下檢出，因此本實驗選擇綠原酸與蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷4 個成分同時定量分析，研究其動態變化規律。

桑葉經霜前后主要是環境溫度發生變化。平均氣侯溫度與次生代謝產物含量間的相關性分析顯示，氣溫與黃酮類4個成分總和含量呈極顯著負相關，與DNJ含量呈極顯著正相關。不同生長期桑葉中次生代謝產物黃酮類成分在4、5月份氣溫低時含量較高，7、8、9月份氣溫高時含量變低，10、11月份霜降節氣前后（霜降10月23日）隨著氣溫下降含量又明顯升高。DNJ在4、5月份氣溫低時含量較低，7、8月份氣溫較高時，DNJ含量較高，9月份隨著氣溫下降，DNJ含量下降，經霜后含量更低。這些變化說明氣候溫度作為環境脅迫因子，其變化影響了桑葉中次生代謝產物的表達。氣溫高時黃酮類成分含量降低，氣溫低時黃酮類成分含量反而升高，說明較低的氣溫有利于黃酮類成分的合成與積累；而DNJ含量氣溫高時較高，氣溫低時含量變低，說明較高的氣溫有利于生物堿類成分的合成與積累。

桑葉為疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的常用中藥，藥用以采收于初霜后為佳。而桑葉經霜后本研究發現桑葉中生物堿類成分含量變低，黃酮類成分含量變高，因生物堿類成分（DNJ）是降血糖主要活性成分，具有糖苷酶抑制劑的作用，也是桑葉的抗逆性成分，其對疏散風熱、清熱潤肺、清肝明目的功效可能影響較小；桑葉中黃酮類成分具有抗菌、抗炎等生物活性[6]，與疏散風熱、清肺潤燥功效相關。因此，桑葉經霜藥用可能與黃酮類成分有關，其具體機制本課題組正進一步研究。

本研究結果為進一步研究桑葉經霜采收活性成分變化與功效之間的相關性提供了一定理論支持，為闡明桑葉經霜采收的科學內涵提供了實驗依據；同時提示在桑葉資源開發及不同臨床應用上，應重視其不同季節所含的成分變化，根據桑葉不同成分的功效，合理安排采收時間。

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Differential Expression of Secondary Metabolites in Mulberry Leaves before and after Frost

ZHANG Weiwanqi, OUYANG Zhen*, ZHAO Ming, WEI Yuan, SHAO Yang, WANG Zhiwan, WANG Qiang
(School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In order to validate whether or not frosted mulberry leaves have better quality, the flavonoids of mulberry leaves were identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS), the contents of four main components, namely chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin, and astragalin were simultaneously determined by HPLC and the content of 1-deoxynojirimycin (DNJ) was assayed by pre-column derivatization HPLC with fluorescence detection. We investigated dynamic changes in the flavonoid composition and the contents of four individual flavonoids and DNJ in mulberry leaves across seasons. The results showed that the contents of flavonoids in mulberry leaves were lower in July and August when temperature was high and reached their maximum in November or October after frost. The DNJ content of mulberry leaves in July and August reached its maximum and then decreased in September or October with declining temperature to its minimum after frost. It is concluded that alkaloids may contribute little to the functions of mulberry leaves in evacuating wind-heat, clearing away lung-heat and moistening dryness. The medicinal components of frosted mulberry leaves may be associated with flavonoids. This study can provide a theoretical basis for elucidating scientific connotation of frosted mulberry leaves.

mulberry leaves； secondary metabolites； high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)； frost； dynamic change

R284.1

A

1002-6630（2015）08-0109-06

10.7506/spkx1002-6630-201508019

2014-08-08

國家自然科學基金面上項目（81072985/H2801）；國家自然科學基金青年科學基金項目（81102522/H3112）；

江蘇省“六大人才高峰”第七批高層次人才項目；江蘇省產學研前瞻性聯合研究項目（BY2012171）；

江蘇省蘇北科技發展專項資金項目（BC2011461）；江蘇省大學生實踐創新訓練計劃立項（201310299031Z）；

江蘇大學第12批大學生科研立項（12A500）

張魏琬麒（1992—），女，碩士研究生，研究方向為中藥活性成分。E-mail：zwwq410@163.com

*通信作者：歐陽臻（1964—），教授，博士，研究方向為中藥活性成分及新藥開發。E-mail：zhenouyang@ujs.edu.cn