刺參水煮液糖蛋白組成成分分析

陳 寧，趙 君，李月惠，高榮春，衣 萌，汪 珊，楊靜峰，辛丘巖*

刺參水煮液糖蛋白組成成分分析

陳 寧，趙 君，李月惠，高榮春，衣 萌，汪 珊，楊靜峰，辛丘巖*

（大連工業大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

目的：刺參水煮液是刺參加工過程中的副產物，通過對刺參水煮液營養成分的分析有助于將這種海產珍品加工廢棄物轉化為高附加值產品。方法：刺參水煮液經醇沉、透析、凍干，得到刺參水煮液糖蛋白（glycoprotein in sea cucumber boiling water，GSCB）粗制品；采用液相色譜和SepharoseCL-6B凝膠層析柱確定其糖蛋白組成成分及分子質量；采用液相色譜-質譜對1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化的GSCB單糖組成進行分析；采用液相色譜法對其氨基酸組成進行分析。結果：GSCB主要含有2 種糖蛋白，分子質量分別為964.3 kD和2.5 kD。GSCB含有氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖6 種單糖；含有18 種氨基酸，其中含有8 種人體必需氨基酸，占氨基酸總量的38.38%。此外，半必需氨基酸組氨酸的含量在18 種氨基酸中占比最高，占比達到13.21%。結論：GSCB中含有酸性黏多糖物質，并含有多種必需氨基酸和半必需氨基酸，是一種良好的營養糖蛋白物質。對其深入開發將有利于變廢為寶，開發出活性良好的功能保健食品。

刺參；水煮液；糖蛋白；單糖組成；氨基酸組成

全世界海參大約有1 200 種，中國海域分布有140多種，其中可食用的有20多種。刺參為黃渤海地區的主要海參品種。海參具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點，海參體內生理活性物質十分豐富，如海參多糖、海參脂質、海參蛋白、海參皂苷、海參外源凝集素等[1]。刺參體內的多糖物質具有多種生理活性，如抗腫瘤、抗凝血、增強免疫力、降血脂、延緩衰老、促進傷口愈合等[2-6]。隨著近年來海參產業化的深度開發，一些海參加工副產物，如海參腸、海參水煮液也引起了關注。如趙玲等[7]以海參水煮液凍干粉為原料，比較研究了3 種不同蛋白酶酶解后所得到多肽的抗氧化活性；丁建君等[8]從海參水煮液中分離出了具有α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的組分；趙前程等[9]對海參加工廢液中多糖的回收方法進行了研究；李天寶等[10]研究了海參加工廢液中多糖的淋巴細胞增殖活性。但迄今為止尚未見到關于海參加工廢液中的糖蛋白營養成分的研究報道。

刺參是我國山東、遼寧和河北沿海一帶珍貴而獨特的海產珍品，因其營養價值豐富，深受消費者喜愛。但在其深度產業化加工過程中，會產生大量刺參水煮液，其中含有豐富的營養成分，如果能夠對其加以綜合利用，既能增加產品的附加產值，變廢為寶，又能減少浪費及環境污染。本實驗對刺參水煮液中糖蛋白的基本組分進行初步的研究，對其單糖組成、氨基酸組成及分子質量進行測定，以期為其營養組分的研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺參（Stichopus japonicus）水煮液 大連棒棰島海產股份有限公 司；牛血清蛋白、瓊脂糖凝膠Sepharose標準品 CL-6B 美國GE公司；不同分子質量葡聚糖Dextran美國Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺（色譜純） 天津光復精細化工研究所；2,4-二硝基氟苯、18 種氨基酸標準品 大連依利特分析儀器有限公司；考馬斯亮藍G-250、單糖標準品 北京Solarbio科技有限公司；三氟乙酸 薩恩化學技術有限公司；無水甲醇（色譜純）山東禹王實業有限公司；乙腈（色譜純） 美國Spectrum公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）（化學純） 國藥集團化學試劑有限公司；氯仿、氯化鈉、無水乙醇、苯酚、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、冰醋酸（均為分析純） 天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV-5200紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；BSZ-100自動部份收集器、HL-2恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；LC-10AT液相色譜儀 日本島津公司；1201型液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；TTL-DC型氮吹儀 北京同泰聯科技發展有限公司；ENT7冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PH070A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；L550臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ELSD2000ES蒸發光檢測器 美國Alltech公司；LXQ液相色譜-線性離子阱質譜儀（配備電噴霧離子源、光電二極管陣列檢測器、XCalibur軟件操作系統）美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 刺參水煮液糖蛋白（glycoprotein in sea cucumber boiling water，GSCB）的制備

鮮活刺參經剖腹、去腸、去牙清洗后，以夾層鍋進行水煮，95 ℃水煮30 min后過濾得刺參水煮液。

刺參水煮液，加3 倍體積無水乙醇醇沉，棄上清液，沉淀經無水乙醇洗后離心（4 000 r/min，10 min）。沉淀用超純水復溶，殘渣再45 ℃水浴助溶后2 次溶液合并離心（4 000 r/min，10 min），取上清液，透析脫鹽，凍干，得到GSCB粗制品。

1.3.2 組成及分子質量測定

糖含量采用苯酚硫酸法進行測定[11]，以葡萄糖為標準品于波長490 nm處比色。蛋白質組成采用考馬斯亮藍G-250法進行測定[12]，牛血清蛋白為標準品于波長595 nm處比色。分子質量檢測采用Sepharose CL-6B柱層析[13]，以質量分數0.9% NaCl溶液為洗脫液，以2.2 mL/12（min·管）的流速進行洗脫，BSZ-100自動部分收集器收集，苯酚-硫酸法跟蹤多糖流出[14]。以標準葡聚糖為分子質量對照，繪制標準曲線。根據樣品流出管數計算分子質量。

1.3.3 液相色譜分析

糖蛋白純度分析采用液相色譜法[15]，以超純水配制樣品1 mg/mL，0.22 μm濾膜過濾后進行液相分析，蒸發光檢測器檢測。

色譜條件：色譜柱TSK4000柱（300 mm×7.8 mm，8 μm）；流動相為超純水；流速0.2 mL/min；上樣量10 μL。1.3.4 糖蛋白中單糖的組成分析

采用PMP柱前衍生化法進行單糖組成分析[16]。樣品經2 mol/L的三氟乙酸水解后，與等體積0.5 mol/L PMP-甲醇混合，于70 ℃條件下反應30 min，水復溶后以質譜進行單糖組成檢測。色譜條件：色譜柱Silgreen ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相20 mmol乙酸銨-乙腈（78∶22，V/V）；流速1 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源；噴霧電壓4.5 kV；毛細管溫度275 ℃；毛細管電壓37 V；鞘氣40 AU；輔助氣10 AU；正離子模式檢測；掃描方式為全掃描；質量掃描范圍m/z 100～2 000。

1.3.5 糖蛋白中蛋白質的氨基酸組成分析

參照依利特公司AAK氨基酸分析系統進行實驗。分別取8 mg樣品加入2 個安醅瓶中，分別加3 mL 6 mol/L鹽酸溶液和3 mL 4 mol/L NaOH溶液至安醅瓶，酒精噴燈高溫拉絲封口，于110 ℃進行酸水解和堿水解，時間24 h。將水解后的樣品轉入蒸發皿，80 ℃水浴蒸干，用衍生緩沖液將蒸干物溶解并轉移進25 mL容量瓶定容。經0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。取經過濾的樣液5 mL定容至25 mL棕色容量瓶，加入2.5 mL 2,4-二硝基氟苯溶液混勻，60 ℃水浴，暗處反應60 min。反應完畢后冷卻至室溫，加平衡緩沖液定容，靜置片刻，用0.45 μm微孔膜過濾，取10 μL進樣。

色譜分離條件：ODS C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫27 ℃；流速1.2 mL/min；檢測波長360 nm。流動相A：乙腈-水（1∶1，V/V）；流動相B：固體組分4.1 g，加水約950 mL溶解，冰醋酸調pH值至6.4～6.8，加10 mL N,N-二甲基甲酰胺，水定容至1 000 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，超聲脫氣10 min。洗脫條件如表1所示。

表 1 GSCB氨基酸組成分析中液相二元梯度洗脫條件Table 1 Binary gradient elution procedures of liquid chromatography for amino acid composition analysis of GSCB

2 結果與分析

2.1 GSCB的組成成分

1 L刺參水煮液經醇沉提取后得干粉263.7 mg，測其總糖含量為質量分數6.23%，蛋白含量為質量分數13.57%。因刺參水煮液中含有大量鹽分，所以需要經過脫鹽處理。提取物經透析后得到GSCB。計算其含量為110.5 mg/L。透析后產物總糖含量增加到質量分數11.87%，蛋白含量增加到質量分數25.47%。由于透析除去了大量鹽分，故多糖和蛋白含量有所提高。刺參多糖是一種糖胺聚糖，因而采用葡萄糖作為標準品檢測糖含量時，所得含量會低于其糖的真實含量。可見，GSCB中蛋白和多糖成分含量均較高。

2.2 GSCB的組分分析

圖 1 GSCB經過分子篩凝膠Sepharose CL-6B柱的色譜圖Fig.1 Elution profile of GSCB on a Sepharose CL-6B column

GSCB是大分子物質，以Sepharose CL-6B凝膠層析柱和配備有TSK4000pw凝膠柱的液相色譜對GSCB進行成分檢測。結果見圖1、2。兩者具有相似的出峰趨勢。由圖1可知，GSCB主要含有2 種大分子糖蛋白，其中較大的糖蛋白分子質量約為964.3 kD；較小的糖蛋白分子質量約為2.5 kD。因液相色譜具有較高的分辨率，圖2中顯示另有2 個峰形較小的糖蛋白出現在高分子質量糖蛋白成分之后。

圖 2 GSCB的凝膠液相色譜圖Fig.2 Elution profile of GSCB by SEC chromatography

2.3 GSCB單糖組成分析

圖 3 GSCB經PMP衍生化后液相色譜-質譜聯用單糖組成分析Fig.3 LC-MS analysis of monosaccharide composition of GSCB derivatized with PMP

GSCB經PMP衍生化后，液相色譜-質譜聯用分析得到6 個主要總離子流峰（圖3）。對照標準單糖的出峰時間與質荷比對GSCB的單糖組成進行定性；以出峰面積對單糖組成進行定量。由表2可知，GSCB含有6 種單糖，其中氨基葡萄糖、甘露糖和巖藻糖為GSCB的主要成分。這與海參體壁黏多糖是一種酸性黏多糖的報道[17-19]相符。研究表明酸性黏多糖一般具有抗腫瘤、抗凝血、提高免疫力等一系列的生理活性，因此GSCB很有可能具有相應的生理活性功能。此外，有報道[20]認為海參體內的巖藻聚糖硫酸酯具有抗腫瘤轉移作用，刺參水煮液單糖組成中高占比質量分數（23.81%）的巖藻糖暗示其可能具有抗腫瘤轉移的活性。

表 2 GSCB的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of GSCB

2.4 GSCB的氨基酸組成分析

表 3 GSCB的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of GSCB

對GSCB進行酸水解和堿水解，并與標準品圖譜進行比較，得到GSCB的總氨基酸組成情況，如表3所示。根據聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界衛生組織（World Health Organization，WHO）推薦的理想蛋白質模式，優質蛋白質的必需氨基酸（essential amino acid，EAA）與總氨基酸（total amino acid，TAA）比值應在40%左右，EAA與非必需氨基酸（non essential amino acid，NEAA）比值應大于60%[21]。從表3可以看出，GSCB中含有18 種氨基酸，其中含有8 種人體EAA，計算其EAA/TAA為38.38%，計算其EAA/NEAA為62.28%。此外，半必需氨基酸中組氨酸的含量在18 種氨基酸含量中最高，計算占TAA比例達到13.21%；精氨酸含量占比為4.65%。由此可見，刺參水煮液中的蛋白成分為高營養蛋白，適宜攝入以補充人體EAA。

2.5 GSCB氨基酸營養評價

表 4 GSCB必需氨基酸組成評價Table 4 Essential amino acid evaluation of GSCB

將GSCB成分的EAA組成與FAO/WHO建議的氨基酸評分標準模式和全雞蛋蛋白質的氨基酸模式進行比較，得出其氨基酸評分（amino acid score，AAS）、化學評分（chemical score，CS）和必需氨基酸指數（essential amino acid index，EAAI）（表4）。根據表4可知，其限制性氨基酸為Met＋Cys，除此之外其AAS及CS數據均接近或大于1，說明GSCB EAA不僅含量高，其合理的構成比例也決定了其高營養價值。EAAI越接近100，食物蛋白與標準蛋白的EAA組成越接近，經計算，GSCB的EAAI高達73.97，遠高于中國明對蝦（52.58）等高營養價值食品[22-23]。與人體蛋白質氨基酸模式相比，該模式組成較均衡，且含量豐富，是高生物價蛋白質。此外，其賴氨酸含量也相當豐富，可以彌補以谷物為主要膳食人群的賴氨酸攝入不足，平衡和提高氨基酸利用率；賴氨酸還是人乳中的第一限制性氨基酸，可作為催乳制劑成分。

3 結 論

刺參水煮液副產物中含有大量活性糖蛋白成分，其中主要成分為分子質量約為964.3 kD和分子質量約為2.5 kD的2 種糖蛋白物質。GSCB中的多糖是一種酸性黏多糖，含有氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖。其蛋白成分中含有18 種氨基酸，其中含有人體EAA 8 種。刺參水煮液作為刺參加工過程中的廢棄副產物，其含有多種人體所需的營養成分，如果能夠對副產物刺參水煮液進行深度加工利用，必將提高我國海參的精深加工程度，減少資源的浪費，帶來可觀的經濟效益。其糖蛋白的結構及營養活性還有待于更深一步的研究。

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Chemical Composition of Glycoprotein from Boiling Water Extract of Sea Cucumber

CHEN Ning, ZHAO Jun, LI Yuehui, GAO Rongchun, YI Meng, WANG Shan, YANG Jingfeng, XIN Qiuyan*
(National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

Aim: To analyze the nutrient compositions of boiling water extract of sea cucumber, a by-product of the processing of this valuable seafood. Methods: Glycoprotein from sea cucumber boiling water (GSCB) was prepared from by alcohol precipitation, dialysis and lyophilization. The components and molecular weight of the crude glycoprotein were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and Sepharose CL-6B column chromatography, respectively. GSCB was hydrolyzed, derivatized with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, and then analyzed for monosaccharide composition by LCMS. The amino acid analysis was carried out by HPLC. Results: Two kinds of glycoprotein in GSCB, with molecular weights of 964.3 and 2.5 kD, respectively, were identifi ed. GSCB was composed of glucosamine, mannose, galactosamine, glucose, galactose and fucose. GSCB contained 8 kinds of essential amino acids, which account for 38.38% of the total amino acids. Besides, the content of semi-essential amino acid, histidine, accounted for 13.21% of the total amino acids, which was the most abundant among the 18 kinds of amino acids. Conclusion: Boiling water extract of sea cucumber contains acid mucopolysaccharides and a high amount of essential amino acids. It is a good nutritive material and can be developed into functional and healthy foods.

sea cucumber; boiling water; glycoprotein; monosaccharide composition; amino acid composition

Q538

A

1002-6630（2015）08-0125-04

10.7506/spkx1002-6630-201508022

2014-09-09

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301430）

陳寧（1988—），女，碩士研究生，研究方向為水產品加工。E-mail：1029023257@qq.com

*通信作者：辛丘巖（1959—），男，高級工程師，學士，研究方向為水產品加工。E-mail：1411892057@qq.com