高效液相色譜手性拆分法分析生物體內(nèi)蝦青素光學(xué)異構(gòu)體

楊 澍，張 婷，徐 杰，李學(xué)敏，周慶新，薛長(zhǎng)湖*

高效液相色譜手性拆分法分析生物體內(nèi)蝦青素光學(xué)異構(gòu)體

楊 澍，張 婷，徐 杰，李學(xué)敏，周慶新，薛長(zhǎng)湖*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

建立一種高效液相色譜手性拆分法分析不同生物中3 種蝦青素光學(xué)異構(gòu)體含量的方法。以Chiralpak IC色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為固定相，以甲基叔丁基醚-乙腈（95∶5，V/V）為流動(dòng)相，采用等度洗脫，流速1.0 mL/min，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為476 nm，選用雨生紅球藻、紅法夫酵母、南美白對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、三文魚、梭子蟹7 種生物樣品為研究對(duì)象，分析其蝦青素光學(xué)異構(gòu)體，線性范圍為0.1～50 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，回收率為86.2%～98.3%，方法穩(wěn)定性良好。結(jié)果表明，該方法可行、快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠。

蝦青素；光學(xué)異構(gòu)體；手性分析；高效液相色譜

蝦青素是一種天然的類胡蘿卜素，化學(xué)名稱為3,3’-二羥基-β,β-胡蘿卜素-4,4’-二酮，分子式為C40H52O4，相對(duì)分子質(zhì)量為596.86[1]，廣泛存在于海洋動(dòng)植物體內(nèi)，如蝦[2]、蟹[3]、野生三文魚[4]、微藻[5]等。它是由4 個(gè)異戊二烯單位以共軛雙鍵形式連接，其2 個(gè)手性中心分別位于兩端環(huán)結(jié)構(gòu)中的C-3和C-3’處，并都能以右旋R或左旋S的形式存在，產(chǎn)生3 種光學(xué)異構(gòu)體：一對(duì)外消旋型蝦青素（左旋型3S,3’S和右旋型3R,3’R）和內(nèi)消旋型蝦青素（3S,3’R）（圖1）[1]。人工合成蝦青素主要為3 種結(jié)構(gòu)蝦青素的混合物（3S,3’S占25%、3R,3’R占25%，3S,3’R占50%左右）[6]，抗氧化活性較弱，而紅法夫酵母中的蝦青素是以3R,3’R為主，具有部分活性[7]。已知藻源蝦青素是以3S,3’S為主，具有極強(qiáng)的抗氧化活性[6]。近年來許多研究表明，3S,3’S蝦青素具有重要的生物學(xué)功能，如抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力[11]等。

蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的分離及定量采用較多的為化學(xué)衍生高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，主要通過將蝦青素與4,7,7-三甲基-3-氧代-2-氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-1-甲酸在一定條件下反應(yīng)形成蝦青素非對(duì)映體衍生物，然后采用Spherisorb S-5CN作為固定相，以正己烷-醋酸異丙基酯-丙酮作為流動(dòng)相進(jìn)行分離[12]。這種方法存在步驟復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，并只能對(duì)游離蝦青素的光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行測(cè)定。有報(bào)道直接通過HPLC法對(duì)蝦青素進(jìn)行拆分。Abu-Lafi等[13]采用Pirkle L-亮胺酸手性柱，正己烷-異丙醇-水作流動(dòng)相對(duì)蝦青素洗脫分離。Grewe等[14]采用反相手性柱Chiralcel OD-RH對(duì)蝦青素進(jìn)行分離。但是采用上述方法對(duì)蝦青素3 種光學(xué)異構(gòu)體的拆分很難達(dá)到基線分離。

圖 1 蝦青素光學(xué)異構(gòu)體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Stru ctures of astaxanthin stereoisomers

近年來，有研究通過測(cè)定的蝦青素光學(xué)異構(gòu)體比例對(duì)野生和養(yǎng)殖三文魚進(jìn)行鑒別[15]。研究顯示，不同生物體內(nèi)蝦青素的光學(xué)異構(gòu)體組成可能具有顯著差異[2,16]，并可通過弄清蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的組成鑒別其生物來源。對(duì)于蝦、蟹、三文魚等海洋水產(chǎn)品中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的比例及含量并不十分清楚。由于天然蝦青素主要以蝦青素酯的形式存在于蝦、蟹、藻等水產(chǎn)品中，多數(shù)已報(bào)道的分離方法也無法直接應(yīng)用于生物體中蝦青素的分析，需要先進(jìn)行酯水解的預(yù)處理。蝦青素酯的水解研究[17]，主要圍繞皂化[18-19]和酶解[20]。常用的皂化法會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物蝦紅素及半蝦紅素的產(chǎn)生[21]，又造成定量困難。

本實(shí)驗(yàn)采用膽固醇酯酶使蝦青素酯完全水解，再通過HPLC法對(duì)不同樣品中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行手性拆分和含量測(cè)定，為后續(xù)生物體內(nèi)蝦青素的綜合利用與開發(fā)提供方法基礎(chǔ)，對(duì)研究及鑒別不同生物來源的蝦青素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、三文魚、梭子蟹 青島南山水產(chǎn)市場(chǎng)；雨生紅球藻 云南愛爾發(fā)生物技術(shù)有限公司；紅法夫酵母 通派（上海）生物科技有限公司；人工合成蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度為（97.3±0.5）%；3S,3’S、3S,3’R及3R,3’R蝦青素比例為1∶2∶1） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；膽固醇酯酶（1 000 U，037-11221） 日本和光純藥株式會(huì)社；丙酮（色譜純）、甲基叔丁基醚 美國(guó)Muskegon公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙酸乙酯、丙酮、正己烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；ab135-S精密分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300E超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；Q超純水器 美國(guó)Millipore公司；DTU-1C氮吹儀 日本Taitec公司；HH-6恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋 常州潤(rùn)華電器有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；1100系列高效液相色譜儀（配自動(dòng)進(jìn)樣器和二極管陣列檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液配制

雨生紅球藻和紅法夫酵母樣品溶液：稱取新鮮藻粉或新鮮酵母粉0.1 g（±5%），加入3 mL甲醇-乙酸乙酯-石油醚（1∶1∶1，V/V），研磨5 min，倒入10 mL具塞離心管中，4 ℃離心，3 500 r/min，5 min，收集上清液。重復(fù)提取3 次，直至藻粉無色。收集提取液，氮?dú)獯蹈桑偌尤? mL丙酮溶液復(fù)溶。

蝦、蟹、魚等樣品溶液：將新鮮南美白對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、三文魚、梭子蟹分別均質(zhì)勻漿，稱取每種樣品0.3 g（±5%），加入3 mL甲醇-乙酸乙酯-石油醚超聲浸提，收集上層相，抽濾，反復(fù)浸提3 次直至樣品無色。上述收集液氮?dú)獯蹈桑偌尤?mL丙酮溶液復(fù)溶。

上述復(fù)溶樣品以丙酮作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)476 nm處讀取吸光度，吸光度應(yīng)介于0.2～0.8之間，如不在其間，進(jìn)行稀釋處理，即得到樣品溶液。

1.3.2 樣品溶液酶解

準(zhǔn)確量取樣品溶液1.0 mL置于10 mL具塞離心管中，加入2 mL丙酮溶液及2mL 0.1 mol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液后加蓋混勻，于37 ℃水浴鍋中保溫2 min后取出。加入1 mL膽固醇酯酶溶液（4 U/mL）振蕩混勻后，于37 ℃條件下保溫反應(yīng)2 h，每隔15 min振蕩1 次。

酶解后加入0.5 g十水硫酸鈉及2.0 mL石油醚，劇烈振蕩后，于冷凍離心機(jī)中離心3 000 r/min，3 min，收集上層有色溶液。之后再加入2.0 mL石油醚，重復(fù)提取3 次，直至下層水相無色。收集液在低溫避光環(huán)境中氮?dú)獯蹈桑? mL乙腈-甲基叔丁基醚（1∶1，V/V）復(fù)溶，待HPLC分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Chiralpak AD-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；流動(dòng)相：甲基叔丁基醚-乙腈（95∶5，V/V）等度洗脫；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)476 nm。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 線性關(guān)系測(cè)定

精密稱取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入丙酮溶解、定容，配制成50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液，用丙酮稀釋成0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品使用液，進(jìn)行HPLC分析。記錄色譜峰3S,3’S、3S,3’R以及3R,3’R的峰面積為S1、S2及S3。以拆分后相應(yīng)峰的峰面積Sx為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算各蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并以RSN為3對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定各蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的檢出限。

1.3.4.2 回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品，以日本對(duì)蝦為例，按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)的前處理方法，分別制備供試品3 份，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以檢測(cè)該前處理方法的重復(fù)性。以丙酮和日本對(duì)蝦樣品作為基質(zhì)，分別向0.3 g的2 種基質(zhì)中加入低、中、高3 個(gè)含量水平的蝦青素對(duì)照品（即加入折合質(zhì)量為1.2、2.4、3.6 μg的3S,3’S蝦青素，1.2、2.4、3.6 μg的3S,3’R蝦青素和0.5、1.0、1.5 μg的3R,3’R蝦青素，相當(dāng)于日本對(duì)蝦樣品中相應(yīng)物質(zhì)含量的50%、100%、150%），按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)中方法處理樣品后，通過HPLC測(cè)定蝦青素異構(gòu)體的含量，考察樣品的回收率；每組做3 個(gè)平行。

1.3.4.3 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

取10 mg/L的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，并求算出峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均值，再計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份樣品溶液，于0、1、2、4、6 h測(cè)得其拆分后各蝦青素異構(gòu)體峰面積，并計(jì)算得RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

圖 2 固定相對(duì)蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的拆分效果影響Fig.2 Effect of different stationary phases on the separation of astaxanthin stereoisomers

由于所研究的蝦青素為弱極性化合物，通過查閱相關(guān)資料，正相方法更適合進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)篩選了3 種手性固定相，分別為纖維素型CHIRLPAK AD-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Pickle型Summichiral OA 2000（4.6 mm×250 mm，5 μm）及化學(xué)鍵合型Chiralpak IC（4.6 mm×250 mm，5 μm）。由圖2可知，采用CHIRLPAK AD-H，以正己烷-異丙醇為流動(dòng)相，分析蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)峰，未能實(shí)現(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體的分離。而采用Summichiral OA 2000，并以正己烷-氯仿-無水乙醇為流動(dòng)相，可以觀察到蝦青素分成三連峰，然而不能達(dá)到基線分離（分離度R=1.3），同時(shí)保留時(shí)間過長(zhǎng)。與前兩者比較，采用Chiralpak IC，以甲基叔丁基醚-乙腈為流動(dòng)相，蝦青素三連峰可實(shí)現(xiàn)完全分離（R＞1.5）。由此，確定出基線平穩(wěn)、分離效果最佳的Chiralpak IC柱作為分析用柱。

2.1.2 流動(dòng)相溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化

在Chiralpak IC固定相條件下，選擇4 種不同溶劑系統(tǒng)組成的流動(dòng)相對(duì)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，即正己烷-乙醇（溶劑系統(tǒng)Ⅰ）、正己烷-乙醇-四氫呋喃（溶劑系統(tǒng)Ⅱ）、甲基叔丁基醚-乙醇（溶劑系統(tǒng)Ⅲ）、甲基叔丁基醚-乙腈（溶劑系統(tǒng)Ⅳ），從而優(yōu)化出最佳的流動(dòng)相組成。使用溶劑系統(tǒng)Ⅰ時(shí)，前2 個(gè)色譜峰未能完全分離，并且分析時(shí)間較長(zhǎng)（圖3）；而使用溶劑系統(tǒng)Ⅱ時(shí)，3 個(gè)色譜峰均不能達(dá)到基線分離；溶劑系統(tǒng)Ⅲ也無法實(shí)現(xiàn)良好的分離；只有采用甲基叔丁基醚-乙腈為流動(dòng)相時(shí)符合分離要求，因此本實(shí)驗(yàn)選用溶劑系統(tǒng)Ⅳ作為流動(dòng)相。

圖 3 不同溶劑系統(tǒng)對(duì)蝦青素光學(xué)異構(gòu)體拆分效果的影響Fig.3 Effect of different solvent systems on the separation of astaxanthin stereoisomers

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 定量線性范圍及檢出限

按1.3.4.1節(jié)評(píng)價(jià)該方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍、回歸方程、檢出限及定量限進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表1。

表 1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程、回歸方程、檢出限及定量限結(jié)果Table 1 Regression equations and detection limits of astaxanthin stereoisomers

2.2.2 回收率

按1.3.4.2節(jié)方法測(cè)定，3 個(gè)加標(biāo)水平的蝦青素光學(xué)異構(gòu)體平均回收率結(jié)果見表2。3 種蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的加標(biāo)回收率均在86.2%～98.3%之間，回收率較好，滿足定量要求。

表 2 方法平均回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recoveries for astaxanthin stereoisomers spiked in biological samples

2.2.3 儀器精密度

按1.3.4.3節(jié)方法考察精密度，取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定拆分后蝦青素光學(xué)異構(gòu)體3S,3’S、3S,3’R及3R,3’R峰面積的RSD分別為3.25%、3.33%及3.07%，表明儀器精密度良好，滿足分析要求。

2.2.4 穩(wěn)定性

取同一份樣品溶液，于0、1、2、4、6 h測(cè)得其拆分后蝦青素異構(gòu)體3S,3’S、3S,3’R及3R,3’R峰面積的RSD分別為2.46%、2.92%及2.90%。結(jié)果表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 樣品中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體含量

圖 4 不同生物樣品中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of several biological samples

表 3 不同生物樣品中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體含量Table 3 The contents of astaxanthin stereoisomers in biological samples determined by the developed HPLC method μg/g

按1.3節(jié)方法測(cè)定分析不同生物樣品中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體，結(jié)果見圖4。采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表3。由圖4可知，不同生物體內(nèi)的蝦青素光學(xué)異構(gòu)體組成具有較大差異。雨生紅球藻及三文魚中的3S,3’S蝦青素所占比例較高，而紅法夫酵母中主要以3R,3’R蝦青素為主。中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦及梭子蟹中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體組成比例較為相似。由表3可以看出，不同種類生物所含蝦青素的光學(xué)異構(gòu)體含量差異較大。其中，梭子蟹的蝦青素3 種光學(xué)異構(gòu)體含量均最低；而雨生紅球藻中3 種異構(gòu)體含量最高。蝦蟹類中，日本對(duì)蝦所含蝦青素總含量最為豐富；而蝦青素光學(xué)異構(gòu)體組成上，蝦蟹類略有相似，主要以3S,3’S及3S,3’R含量較多。紅法夫酵母蝦青素只有3R,3’R構(gòu)象。雨生紅球藻中3S,3’S蝦青素含量豐富，是蝦蟹類生物的100 倍以上，可作為良好的左旋蝦青素來源。從表3可看出，不同種類生物所含蝦青素光學(xué)異構(gòu)體組成及含量都具有特征性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC手性拆分法分析不同生物中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體含量的方法快速、簡(jiǎn)便。篩選出

Chiralpak IC柱作為手性分離柱，確立等度洗脫的甲基叔丁基醚-乙腈溶劑系統(tǒng)。采用所建立的方法，對(duì)7 種生物樣品中的蝦青素光學(xué)異構(gòu)體組成及含量進(jìn)行了檢測(cè)，在所測(cè)樣品中，雨生紅球藻3S,3’S蝦青素含量最高為

689.78 μg/g，紅法夫酵母3R,3’R蝦青素含量為337.35 μg/g。本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的分離及定量，為蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的開發(fā)和蝦蟹下腳料的利用提供了數(shù)據(jù)參考，為后續(xù)蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的活性研究提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明該方法可行、快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，前處理步驟較為簡(jiǎn)單，回收率較高，可以應(yīng)用于大部分含蝦青素生物樣品中蝦青素光學(xué)異構(gòu)體含量分析。

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Chiral Separation and Analysis of Astaxanthin Stereoisomers in Biological Organisms by High-Performance Liquid Chromatography

YANG Shu, ZHANG Ting, XU Jie, LI Xuemin, ZHOU Qingxin, XUE Changhu*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for chiral separation and analysis of astaxanthin stereoisomers in several biological organisms was developed. The separation was performed on a Chiralpak IC column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) by using methyl tert-butyl ether (MTBE)-acetonitrile as the mobile phase at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength of diode array detector (DAD) was 476 nm. This method was applied to analyze astaxanthin stereoisomers in Haematococcus pluvialis, Phaffia yeast, Penaeus vannamei, Penacus orientalis, Japanese tiger prawn, salmon and crab. The results showed that the linear range of the calibration curve for astaxanthin stereoisomers was 0.1–50 mg/L with a correlation coeffi cient of 0.999 9. The average recovery rates for astaxantin stereoisomers were in the range of 86.2%–98.3%. These results demonstrate that the proposed method is feasible, rapid, simple and accurate.

astaxanthin; stereoisomers; chiral analysis; high-performance liquid chromatography (HPLC)

TS254.1

A

1002-6630（2015）08-0139-06

10.7506/spkx1002-6630-201508025

2014-07-25

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B07）；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT1188）；山東省自主創(chuàng)新專項(xiàng)（2012CX80201）

楊澍（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)化學(xué)。E-mail：yangshu12@163.com

*通信作者：薛長(zhǎng)湖（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)化學(xué)及水產(chǎn)品加工。E-mail：xuech@ouc.edu.cn