單環刺螠體壁多糖的分離純化、理化性質及抗脂質過氧化活性

朱佳利，陳依莎，牛慶鳳，李 濤，陳 蔭*

單環刺螠體壁多糖的分離純化、理化性質及抗脂質過氧化活性

朱佳利，陳依莎，牛慶鳳，李 濤，陳 蔭*

（浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022）

為研究和開發單環刺螠中活性多糖成分，采用酶法提取和色譜分離技術，從單環刺螠的體壁中提取分離 多糖組分，采用化學和儀器分析方法對其單糖組成、分子質量等理化性質進行研究，并通過體外清除脂質過氧化物實驗對其進行初步的活性評價。結果表明：采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶兩步酶解后，單環刺螠多糖（unicinctus polysaccharide，UP）得率為5.3%。通過離子交換柱層析分離純化后主要得到兩個組分UP-1和UP-2。UP-1是主要由葡萄糖（Glc）組成的高聚葡聚糖，分子質量340 kD，而UP-2為組成復雜的類糖胺聚糖，分子質量約為7.9 kD，主要含有葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、氨基葡萄糖（GlcN）和巖藻糖（Fuc），還含有少量的甘露糖（Man）和氨基半乳糖（GalN）。其單糖組成Man、GlcN、GalN、Glc、Gal、Fuc物質的量比例為1.0∶1.47∶0.64∶6.49∶2.5∶3.0。和其他海洋動物來源類糖胺聚糖類似，UP-2還含有少量的硫酸基，含量為7.4%。對UP-1和UP-2進行初步體外抗氧化活性研究表明，類糖胺聚糖UP-2具有顯著的脂質過氧化物清除活性，半數清除質量濃度為5.0 mg/mL。

單環刺螠；多糖；分離純化；理化性質；抗氧化

單環刺螠（U rechis unicinctus）為螠蟲動物門螠綱無管螠目刺螠科動物，是無管螠目在我國沿海分布的唯一種類，俗稱“海腸子”。單環刺螠個體肥大，肉味鮮美，體壁肌富含蛋白質和多種人體必需氨基酸，經常食用海腸能夠起到溫補肝腎、壯陽固精的作用。自古以來，我國、日本和朝鮮沿海地區的居民均將單環刺螠作為名貴的海鮮食品，有較高的經濟價值。膠東地區是我國單環刺螠的最大產地，是一種極有養殖開發前景的海洋動物資源[1]。

研究[2-4]表明：單環刺螠體內含有多種生物活性肽，如纖溶酶、速激肽和其他的一些多肽類，具有一定的抗腫瘤及提高小鼠免疫功能及抗血栓的活性。因此作為一種研究海洋生物活性物質的良好材料，開展針對單環刺螠活性物質的研究，對開發海洋藥用生物資源，促進其養殖產業的發展和提高經濟產值起到積極的推動作用。單環刺螠由于其豐富的營養價值又被人們稱為“裸體海參”，而海參多糖是海參中重要的活性成分，多糖也是很多海洋動物中的主要的活性物質，具有多種生物活性。本實驗對單環刺螠體壁中的多糖進行提取分離純化和理化性質研究，為其多糖類活性物質的開發提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單環刺螠購于青島齊東路水產市場，由浙江海洋學院趙盛龍教授鑒定確認。

單糖標準品、牛血清蛋白標準品 美國Sigma公司；不同分子質量葡聚糖標準品 美國Fluka公司；Folin-酚乙液、重蒸酚 北京鼎國生物工程公司；95%乙醇、丙酮、濃硫酸、咔唑、四硼酸鈉、對二甲氨基苯甲醛、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸鈉、三氟乙酸、溴化鉀、硫代巴比妥酸、乙酰丙酮等均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TD5K低速大容量離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司；HH-1型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；UV-1100型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；AKTA FPLC快速蛋白質液相色譜儀 瑞典Pharmacia Biotech公司；1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；FD-1000真空冷凍干燥機、旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；Model 818數字pH計上海奧立龍公司；FD-1C-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單環刺螠體壁多糖的提取[5]

單環刺螠從一端剪開后棄掉體腔液和內臟并用清水洗凈，剪碎后勻漿。丙酮攪拌脫脂過夜，離心棄去上清液，沉淀40 ℃烘干過夜后粉碎。取單環刺螠體壁粉按1∶20（g/mL）加入蒸餾水，并調節pH 8～9于80 ℃堿化12 h，然后調節pH 6.8，加入質量分數1%木瓜蛋白酶在60 ℃水浴中消化4 h，接著采用胰蛋白酶水解3 h、提取溫度60 ℃、pH 10、加酶量0.5%（質量分數）。提取完成后調pH值至中性后100 ℃水浴加熱15 min滅酶。兩步酶解以保證多糖分子充分的釋放和溶解。在離心機中4 500 r/min離心20 min后取上清液，減壓濃縮至原體積的1/20后，使用95%乙醇沉淀多糖，使乙醇終體積分數約為80%，于4 ℃冰箱中放置過夜。離心后獲得的多糖重新溶解后采用截留相對分子質量為3 500的透析袋于純水中連續透析2 d后濃縮后冷凍干燥。采用Seveg法除蛋白后得到單環刺螠多糖（unicinctus polysaccharide，UP）。

1.3.2 單環刺螠體壁多糖的分離純化

將粗多糖溶于少量蒸餾水中，配制成50 mg/mL多糖溶液，在AKTA FPLC快速蛋白純化系統上，采用陰離子交換柱Q Sepharose Fast Flow柱（2.6 cm×50.0 cm）以0～2 mol/L的NaCl溶液線性洗脫，根據線性洗脫結果確定梯度洗脫的條件，自動部分收集（每管收集7 mL）后以苯酚-硫酸法檢測各梯度中多糖組分的位置，分別收集相應梯度的多糖組分，透析脫鹽后濃縮凍干得純化后多糖樣品。

1.3.3 單環刺螠體壁多糖的單糖組成分析

海洋動物多糖中一般單糖組成比較復雜，本實驗采用完全酸水解后PMP柱前衍生高效液相色譜法分析其單糖組成。采用PMP衍生化方法[6]，對等濃度配制的單糖標準品和各多糖全水解后產物進行PMP衍生，然后進行液相色譜分析。色譜條件為：Agilent XDB-C18色譜柱；柱溫：35 ℃；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH6.7）-CH3CN（83∶17，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測器：二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）（245 nm）。

1.3.4 單環刺螠體壁多糖的分子質量分布

采用高效凝膠滲透色譜法[7]分析單環刺螠多糖的純度及分子質量范圍，色譜條件：色譜柱：Shodex Ohpak SB-804HQ凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）；柱溫：35℃；流動相：0.1 mol/L的Na2SO4溶液；流速：0.5 mL/min；檢測器：示差檢測器（refractive index detector，RID）。

1.3.5 單環刺螠體壁多糖的理化性質研究

以葡萄糖為標準品，采用硫酸-苯酚法測定總糖含量[8]。以牛血清蛋白為標準品，采用Folin-酚法測定蛋白含量[9]。以葡萄糖醛酸作為標準品，采用咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量[10]。以硫酸鉀為標準品，采用氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸根含量[11]。采用Elson-Morgan法，以氨基葡萄糖為標準測定氨基糖含量[12]。

1.3.6 單環刺螠體壁多糖的紅外光譜分析

采用KBr壓片法，將約為0.1 mg多糖樣品與適量干燥溴化鉀粉末研磨混合均勻后，研制成透明薄片在Nicolet Nexus 470型紅外光譜進行測定。紅外光譜儀測定參數：背景掃描次數32次；掃描范圍400～4 000 cm-1；分辨率4.0 cm-1；檢測器：氘化三甘氨酸硫酸酯檢測器（deuterated triglycine sulfate detector detector，DTGS）[13]。

1.3.7 抗脂質過氧化活性分析

用0.1 mol/L pH 7.45的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制卵黃懸液（V（卵黃）∶V（PBS） = 1∶25），吸取卵黃懸液0.4 mL，在試管中分別加入不同質量濃度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的被測溶液1.0 mL，再加入0.4 mL 25 mmol/L的硫酸亞鐵，用0.1 mol/L pH 7.45的PBS補充至4 mL，37 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩15 min，取出后加入1.0 mL 20%的三氯乙酸靜置10 min，3 500 r/min離心10 min，吸取4 mL上清液加入2 mL 0.8%的硫代巴比妥酸，加塞，放入沸水浴中15 min，冷卻后，以空白管（6 mL PBS代替）調零，532 nm波長處比色測定吸光度；不加樣品管的吸光度A0，樣品管的吸光度A，以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）作為陽性對照，樣品抗氧化活性用對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率表示[14]，即：

式中：I為抑制率/%；A0為對照管的吸光度；A為樣品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單環刺螠體壁多糖的提取與分離純化

動物中含有豐富的蛋白質，很多動物多糖和蛋白質通過共價鍵相連接，蛋白酶水解法和堿水解是目前動物多糖提取過程中使蛋白質和聚糖分離廣泛應用的兩種方法。堿提多糖是基于蛋白多糖中的糖肽鍵對堿的不穩定性，但也存在部分糖苷鍵降解的問題，濃度不易過大。為保證多糖成分充分的釋放本實驗采用稀堿水解后木瓜蛋白酶和胰蛋白酶進一步酶解，以除掉其結合蛋白，并進一步使用Seveg法去除游離的蛋白，最終多糖的得率為5.3%（基于烘干后原料）。

根據多糖的電荷分布不同，采用陰離子交換柱層析對單環刺螠體壁粗多糖進行分離純化。根據線性洗脫選擇梯度洗脫條件，最終確定以純水和0.25 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫（圖1），苯酚-硫酸檢測后分別按峰收集，濃縮透析除鹽，凍干得到水洗、0.25 mol/L洗脫組分，水洗組分為白色粉末狀，鹽洗組分為淡黃色粉末，分別命名為UP-1和UP-2，二者得率分別為45%和30%（基于粗多糖）。

圖 1 單環刺螠粗多糖在Q Sepharose Fast Flow柱上的梯度洗脫圖Fig.1 Gradient elution profile of the crude polysaccharides on Q sepharose fast flow column

2.2 單環刺螠體壁多糖的單糖組成分析

對單環刺螠體壁多糖水洗組分UP-1和鹽洗組分UP-2進行單糖組成分析表明，二者的單糖組成存在很大差異（圖2）。UP-1單糖組成為葡萄糖（Glc），表明UP-1為一種葡聚糖。而UP-2單糖組成較為復雜，主要含有葡萄糖（Glc），以及半乳糖（Gal）、氨基葡萄糖（GlcN）、巖藻糖（Fuc）和少量的甘露糖（Man）、氨基半乳糖（GalN）。從單糖組成可以看出UP-2為組成復雜的類糖胺聚糖，其單糖組成Man、GlcN、GalN、Glc、Gal、Fuc物質的量比例為1∶1.47∶0.64∶6.49∶2.5∶3.0。

圖 2 PMP柱前衍生UP-1（A）、UP-2（B）和10 種單糖標準品（C）高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of UP-1 (A), UP-2 (B) and mixture of ten monosaccharide standards (C) using pre-column derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP)

2.3 體壁多糖的分子質量分析

對離子交換柱層析純化組分UP-1和UP-2進行純度和分子質量分析。如圖3所示，經過純化后UP-1和UP-2純度較高，特別是UP-2呈現單一對稱峰。二者在相對分子質量上也存在很大差異，UP-1分子質量約為340 kD，而UP-2分子質量約為7.9 kD。

圖 3 UP-1和UP-2的高效凝膠滲透色譜圖Fig.3 HPGPC chromatograms of UP-1 and UP-2

2.4 單環刺螠體壁多糖的理化性質分析

多糖的理化性質為多糖進一步的結構鑒定和活性篩選提供重要的參考價值。通過紫外分光光度法對UP-1和UP-2的理化性質進行比較分析。UP-1總糖含量較高94.7%，不含有蛋白和硫酸基。UP-2總糖含量為67%，可能是由于氨基糖在硫酸-苯酚反應中不顯色及其他單糖對顯色反應的干擾造成了誤差[15]。UP-2含有3%左右的蛋白，16%的氨基糖，另外，和很多其他來源的海洋類糖胺聚糖一樣，UP-2含有少量的硫酸基取代，含量為7.4%。

2.5 單環刺螠體壁多糖的紅外光譜分析

圖 4 UP-1和UP-2的紅外光譜Fig.4 IR spectra of UP-1 and UP-2

對UP-1和UP-2的紅外光譜進行比較分析（圖4）可知，二者的結構存在很大差異。UP-1的紅外光譜是典型的多糖紅外光譜。3 405 cm-1處的信號為多糖OH的伸縮振動吸收峰；在2 930 cm-1附近處的信號為糖環上的次甲基和亞甲基中的C—H伸縮振動的吸收峰；1 021、1 085 cm-1和1 160 cm-1處的吸收信號為C—O和C—O—C的伸縮振動，三者的同時存在表征了吡喃糖環的伸縮振動峰；850 cm-1處的吸收表明糖基中存在α構型；932 cm-1處的吸收表明UP-1的葡聚糖為D-構型；1 640 cm-1處的吸收為多糖類物質常見的微量水分締合羥基造成。由此可以初步推測UP-1主要由α-D-吡喃葡萄糖構成。而UP-2在3 400 cm-1附近有更強的吸收，示意除了O—H的伸縮振動外還有氨基N—H的伸縮振動；1 651 cm-1和1 400 cm-1的強和中強吸收，分別是C＝O的對稱伸縮振動和非對稱伸縮振動，表明UP-2中羰基的存在，最有可能為乙酰基的羰基，推測UP-2中存在乙酰基取代。1 540 cm-1為N—H的彎曲振動；在1 239 cm-1處有弱的吸收，示意O—SO3—的S＝O 鍵伸縮振動，進一步表明UP-2中存在硫酸基的取代。綜合以上分析可知，UP-2為部分硫酸取代的富含氨基的雜多糖，可能存在乙酰基取代[13,16]。

2.6 單環刺螠體壁多糖的抗脂質過氧化作用

糖胺聚糖是很多海洋生物如海參、扇貝的重要活性成分，具有廣泛的生物活性，而調節血脂是其重要的活性之一。研究表明海洋糖胺聚糖能夠有效地降低脂質過氧化物的產生，通過自由基的清除達到調節心血管并延緩衰老的作用[17]。為快速表征單環刺螠體壁多糖對脂質過氧化物的清除作用，采用體外抗脂質過氧化模型對其清除自由基活性進行評價。如圖5所示，通過對比分析，體壁多糖中的類糖胺聚糖成分UP-2和UP-1相比，體現出良好的體外抗脂質過氧化活性，在10 mg/mL時對自由基的清除率超過80%，其半數清除質量濃度為5.0 mg/mL。表明單環刺螠體壁多糖存在較好的脂質過氧化物清除作用，而類糖胺聚糖的活性要優于葡聚糖，推測類糖胺聚糖是單環刺螠體壁多糖的主要活性成分，其生物活性有待進一步深入開發。

圖 5 UP-1和UP-2的脂質過氧化物清除曲線Fig.5 Inhibition curves of lipid peroxidation by UP-1 and UP-2

3 討 論

單環刺螠以其對硫化物的耐受力及富含活性多肽而受到關注，對其多糖類活性成分的研究較少。本實驗對單環刺螠體壁多糖進行系統分析。很多海洋動物中含有硫酸化類糖胺聚糖。不同來源的類糖胺聚糖在硫酸基含量、單糖組成和分子質量上均有很大的區別。海參中的糖胺聚糖由乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸和巖藻糖組成，鮑魚中的硫酸化糖胺聚糖主要含有半乳糖、葡萄糖、木糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸。海灣扇貝中主要含有硫酸化的氨基己糖、己糖醛酸，還含少量的鼠李糖、巖藻糖、木糖、半乳糖和葡萄糖，魷魚墨中含有的類糖胺聚糖由乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸和巖藻糖組成，由此可見海洋動物是糖胺聚糖的重要來源[14,18-21]。單環刺螠來源糖胺聚糖分子質量分布與大部分海洋糖胺聚糖類似，為8 kD，低于20 kD，也存在一定的硫酸基取代，但單糖組成上存在很大的區別。單環刺螠主要含有葡萄糖、半乳糖和氨基己糖，還含有少量的甘露糖和巖藻糖，不含有糖醛酸，表明單環刺螠來源的類糖胺聚糖為結構較為新穎的海洋類糖胺聚糖。

海洋糖胺聚糖具有豐富的生物活性，在免疫調節、抗腫瘤、抗凝血和調節血脂等方面都具有顯著的生物活性。扇貝裙邊糖胺聚糖可顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，與環磷酰胺聯用有減毒增效的作用，且有增強小鼠的免疫功能[22]。刺參酸性黏多糖能顯著地抑制小鼠S180腫瘤和乳癌細胞DNA的合成。王靜鳳等[23]研究表明日本刺參能增強B細胞、T細胞、NK細胞和巨噬細胞等的功能，從而促進荷瘤小鼠細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫效應細胞殺傷體內的腫瘤細胞。劉宗保等[24]發現刺參糖胺聚糖在200～250 mg/L質量濃度范圍表現出抗風疹病毒活性，呈一定的量效關系，并無明顯細胞毒性作用。張佩文等[25]研究發現玉足海參酸性黏多糖抗凝血作用顯著，可延長血漿凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間、血漿凝血酶原時間，目前已開發為具有抗凝和降低血脂的功效的藥品。閔詩剛等[26]研究表明：烏賊墨多糖能極其顯著地降低白細胞、血小板、紅細胞數量和過氧化氫酶的活力，代償性升高丙二醛含量，對環磷酰胺引起的免疫系統和抗氧化能力損傷，有顯著的拮抗作用及促進其快速恢復的功效。而對單環刺螠體壁糖胺聚糖初步體外活性研究表明，其也呈現良好的體外脂質過氧化物的清除活性，提示其可能存在調節血脂、預防動脈粥樣硬化相關的活性，具有進一步深入研究的價值[27]。

本實驗以單環刺螠的體壁為原料提取其中的多糖成分，采用多種化學分析方法和現代儀器分析技術對其理化性質、單糖組成及分子質量等進行研究，結果表明單環刺螠體壁含有5%左右的多糖類物質，且多糖分為兩大類型：一類為高分子質量的中性葡聚糖，另一類為組成較為新穎的硫酸化類糖胺聚糖，分子質量為7.9 kD，主要由葡萄糖、氨基葡萄糖和氨基半乳糖組成，還含有甘露糖、半乳糖和巖藻糖，硫酸基含量為7%。初步活性研究顯示單環刺螠體壁糖胺聚糖為主要的活性多糖成分，極具開發價值。為開發單環刺螠這一經濟海產，促進高值化利用，其糖胺聚糖深入的生物活性有待進一步研究。

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Purification, Physicochemical Properties and Anti-Lipid Peroxidation Activity of Polysaccharides from Body of Urechis unicinctus

ZHU Jiali, CHEN Yisha, NIU Qingfeng, LI Tao, CHEN Yin*
(School of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

This study aimed to extract polysaccharides from the body wall of Urechis unicinctus by sequential enzymatic digestion with papain and trypsin and to purify the crude extract by anion exchange column chromatography. The physical and chemical properties such as monosaccharide composition and molecular weight of the purified polysaccharides were investigated on the basis of chemical and modern spectroscopic analysis. Then the antioxidant activity in vitro of the polysaccharides was evaluated. The results showed that the yield of polysaccharides extracted from the body wall of Urechis unicinctus was 5.3%. Two polysaccharides, namely UP-1 and UP-2, were purified from the crude polysaccharides by anionexchange chromatography. UP-1 was a neutral polysaccharide composed of mainly glucose with a molecular weight of 340 kD. UP-2 was a heteropolysaccharide with a molecular weight of about 7.9 kD. UP-2 consisted of mannose, glucosamine, galactosamine, glucose, galactose and fucose at a molar ratio of 1.0:1.47:0.64:6.49:2.5:3.0. The monosaccharide composition revealed that UP-2 was a glycosaminoglycan-like polysaccharide. Like most of glycosaminoglycan-like polysaccharides from marine animals, UP-2 contained 7.4% sulfate ester. The glycosaminoglycan-like polysaccharide had a wide range of bioactivities and better anti-lipid peroxidation activity than UP-1 as evidenced by its EC50value at 5.0 mg/mL.

Urechis unicinctus; polysaccharide; purifi cation; physicochemical property; antioxidant activity

R151.2

A

1002-6630（2015）08-0162-05

10.7506/spkx1002-6630-201508029

2014-07-16

浙江自然科學基金項目（LQ14H300001）；中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室開放基金項目（KLMD（OUC）201402）

朱佳利（1992—），女，本科生，主要從事海洋藥物研究。E-mail：342457383@qq.com

*通信作者：陳蔭（1984—），男，副教授，博士，主要從事海洋藥用生物資源開發研究。E-mail：mojojo1984@163.com