不同粒徑納米金標記二抗增強表面等離子共振檢測E. coli O157∶H7

楊 陽，李榮卓，毛祿剛，劉 霞*

不同粒徑納米金標記二抗增強表面等離子共振檢測E. coli O157∶H7

楊 陽，李榮卓，毛祿剛，劉 霞*

（湖南農業大學食品科學技術學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

基于雙通道表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器，結合不同粒徑的金納米粒子（Au nanoparticle，AuNPs）標記多克隆抗體（polyclonal antibody，PAb）作為第二抗體，采用氨基偶聯的方法將PAb固定在傳感器表面作為第一抗體，采用三明治夾心法進行了檢測大腸桿菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）的研究。考察3 種粒徑的AuNPs作為標記物，增強SPR響應信號檢測E. coli O157∶H7的能力。結果表明，增強效果最佳的AuNPs粒徑為17.79 nm，其可檢測到的E. coli O157∶H7的最低濃度為10 CFU/mL。

金納米粒子；E. coli O157∶H7；表面等離子共振傳感器；標記；不同粒徑

隨著食品產業飛速的發展，食品安全問題越來越得到消費者的關注。據統計，在各種食物中毒事件中，以細菌引起的食物中毒最多。其中大腸桿菌O15 7∶H7（E. coli O157∶H7）是最常見的細菌致病菌[1-2]。目前，檢測E. coli O157∶H7常用的方法有聚合酶鏈式反應（poly merase chain reaction，PCR）[3]、酶聯免疫（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）法[4]、生物傳感器法[5]等。其中，免疫生物傳感器由于其特異性強、快速簡便的優點，已廣泛應用于E. coli O157∶H7的檢測。特別是表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器[6]具有無需標記，能實時監測反應動態過程，操作簡單、靈敏度高，已被廣泛應用于各個研究領域[7-9]。國內外已有關于SPR生物傳感器檢測E. coli O157∶H7的報道，Si Chengyan等[10]將抗體固定在傳感器表面，基于SPR直接法檢測E. coli O157∶H7，檢測限為105CFU/mL。應用納米材料可大幅度提高SPR傳感器的檢測靈敏度[11]，尤其是金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs），由于具有微弱的帶電配體的結合層，具有特殊的穩定性，可以與生物分子發生非共價鍵的靜電吸附[12]，且生物分子活性基本不發生改變，標記用量少等優點而被廣泛應用于生物檢測。AuNPs標記抗原或抗體的三明治法檢測E. coli O157∶H7已有報道，劉霞等[13]應用AuNPs標記抗體的方法檢測了補體C4，與直接法檢測相比，靈敏度提高了20 倍。Eum等[14]基于AuNPs的增強響應信號作用，應用三明治夾心法，將AuNPs-抗體作為二抗，原抗體為一抗檢測E. coli O157∶H7，結果表明在標記AuNPs的前提下響應信號比沒有標記的高3.8 倍。

本實驗分別將不同粒徑的AuNPs標記E. coli O157∶H7 PAb作為第二抗體，以固定在SPR傳感器芯片表面的PAb作為第一抗體，應用三明治夾心法[15]對E. coli O157∶H7進行檢測，比較了3 種不同粒徑的AuNPs增強SPR響應信號的能力，篩選出最佳尺寸的AuNPs，并應用篩選出的AuNPs進行實際樣品的加標回收率實驗。此方法簡單快速，為SPR傳感器在實際樣品中的檢驗提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無水乙醇、營養肉湯（nutrient broth，NB）、檸檬酸三鈉、四氯金酸（HAuCl4·H2O）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 國藥集團化學試劑有限公司；3-巰基丙酸（3-mercapto propionic acid，MPA）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）美國Sigma-Aldrichg公司；E. coli O157∶H7由湖南省食品藥品檢驗研究院提供（出血性大腸埃希氏菌二代菌株，編號為CICC21530，中國工業菌種保藏中心）；羊抗O157∶H7 PAb 美國International Lab公司；實驗所用試劑均為分析純。

HJ-1型恒溫磁力攪拌器 江蘇醫療儀器廠；雙通道2000 SPR傳感器和芯片 美國Biosensing Instrument公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；JSM-6380LV型透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；磷酸鹽緩沖液（150 mmol/L NaCl＋20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 7.4）；實驗用水為去離子水；實驗所用玻璃器皿、磷酸鹽緩沖液、去離子水及槍頭均經高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 AuNPs合成及表征

采用檸檬酸三鈉還原法制備AuNPs[16]，具體步驟如下：分別取0.5 mL質量分數為1%氯金酸溶液于三角瓶中，加入49.5 mL去離子水，在磁力攪拌器200 r/min攪拌并加熱至沸騰，沸騰后分別快速加入新配制的1、1.5、2 mL質量分數為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱攪拌10 min。溶液顏色由灰色變成黑色，最后變成透亮的紅色后停止加熱，再攪拌10 min。室溫冷卻后分裝到離心管中并分別采用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）和紫外-可見分光光度計（ultravioletvisible spectrophotometer，UV-Vis）進行表征。

1.2.2 AuNPs-PAb復合物的制備及表征

應用目測法測定PAb最適標記量，將PAb逐級稀釋后，各取等體積分別加入到一系列裝有1 mL AuNPs的離心管中，離心5 min后，在上述各管內再分別加入0.1 mL質量分數為10%的NaCl溶液調節pH值至7.4，混勻靜置2 h以上觀察結果。若加入PAb不足以穩定AuNPs的離心管，即呈現由紅變藍的聚沉現象，而加入PAb達到或超過最低穩定量的離心管則AuNPs的紅顏色不變。其中含PAb最低的離心管即含穩定1 mL AuNPs的必需蛋白量[17]。根據用已標記的AuNPs的總量計算出所需要的待標記PAb的總量（實際實驗中增加20%的量），然后在電磁攪拌器的攪拌下，將PAb溶液逐滴加入AuNPs溶液中（pH 7.4），1 mg的PAb大約5 min加完；在磁性攪拌器的攪拌下，加入pH 7.4的BSA作為封閉劑，并使其最終質量分數為1%。得到的混合液用2 000 r/min離心20 min，去除沉淀，即除去部分大顆粒的AuNPs。所得上清液用10 000 r/min離心60 min后小心除去上清液，即除去未結合的PAb。所得沉淀（AuNPs-PAb復合物）用磷酸鹽稀釋并用TEM進行表征。

1.2.3 PAb在傳感器表面的固定

室溫條件下，采用滴加的方法，將濃度為10 mmol/L的MPA乙醇溶液滴加在裸露的芯片表面，室溫孵育過夜，次日芯片用乙醇以及二次水反復沖洗，再用氮氣吹干，使MPA在芯片上形成穩定的單分子膜，然后將芯片組裝在SPR傳感器上。通入新配制的EDC/NHS（0.4 mol/L∶0.1 mol/L）活化MPA中的羧基，流速為40 μL/min；再通入的質量濃度為111.2 μg/mL的PAb（磷酸鹽緩沖液配制）溶液，流速為5 μL/min，將其固定在傳感器芯片表面，最后通入1% BSA封閉芯片表面的非特異性吸附位點。

1.2.4 SPR檢測

通入一定濃度的E. coli O157∶H7標準菌液，流速為10 μL/min，使其與芯片表面的PAb充分反應，然后再分別通入3 種粒徑的AuNPs-PAb復合物進行檢測，檢測過程原理圖如圖1所示。每次反應完畢后以20 μL/min的流速通入10 mmol/L的NaOH溶液，將傳感器表面AuNPs-PAb與E. coli O157∶H7的結合物沖掉至基線穩定后，然后通入其他濃度的E. coli O157∶H7，重復上述步驟，每個濃度的E. coli O157∶H7至少重復檢測3 次。

圖 1 檢測過程原理圖Fig.1 Principle schematic of E. coli O157∶H7 detection

1.2.5 實際樣品的制備及加標回收率實驗

購買自湖南農業大學紅旗市場的涼菜，烘箱烘48 h，用滅菌后的研缽研碎，稱取2.5 g加入22.5 mL無菌水混合均勻，過濾后4 ℃冰箱備用。

稀釋樣液加入E. coli O157∶H7標準菌液，加標后E. coli O157∶H7的最終濃度為106CFU/mL。調節流速為10 μL/min，通入實際樣品加標溶液，進行3次重復檢測，計算回收率。每次檢測后采用10 mmo l/L的NaOH溶液使傳感器表面再生。

2 結果與分析

2.1 AuNPs的表征

應用檸檬酸鈉還原法成功制備了3 種不同粒徑的AuNPs，圖2A分別為3 種粒徑AuNPs的TEM圖，AuNPs粒子形狀較統一，分散也較均勻，并且隨著還原劑檸檬酸三鈉量的不同，粒子粒徑逐漸增大，粒子數量減少。通過使用粒徑分布計算軟件分析了3 種粒子的粒徑，可知此次實驗制備的AuNPs平均粒徑分別為17.79、28.22 nm和34.05 nm（圖2B）。圖3為AuNPs的UV-Vis光譜，3種粒徑的AuNPs在520 nm左右均出現了其紫外特征吸收峰，而且紫外吸收峰隨著顆粒尺寸的增大而出現了紅移，與文獻[18]報道相一致。

圖 2 AuNPs TEM圖（A）和粒徑分布圖（B）Fig.2 TEM images (A) and size distribution histograms (B) of AuNPs

圖 3 AuNPs的UV-Vis光譜Fig.3 UV-visible absorption spectra of AuNPs

2.2 AuNPs-PAb的表征

圖 4 AuNPs標記前后以及抗體的UV-Vis光譜Fig.4 UV-visible absorption spectra of PAb, AuNPs and AuNPs-PAb

由圖4中曲線c可看出，PAb沒有特征峰，而圖4中曲線b可以明顯看出，3 種粒徑的AuNPs分別在波長520 nm左右處都出現了特征吸收峰，但PAb被AuNPs標記后（圖4中曲線a），AuNPs-PAb復合物在525 nm左右出現了吸收峰，AuNPs-PAb復合物的特征吸收峰與AuNPs的特征吸收峰相比，出現了紅移現象，這是因為AuNPs-PAb復合物形成之后，粒子粒徑變大所致，與文獻[18]報道相一致。另外，也可看出AuNPs-PAb復合物的吸光度明顯下降，PAb被AuNPs成功標記。

2.3 SPR檢測結果

圖 5 3種粒徑的AuNPs增強三明治夾心法檢測E. coli O157∶H7的動力學曲線Fig.5 SPR dynamics curves of AuNPs of three different sizes enhanced sandwich assay for E. coli O157∶H7 detection

PAb在SPR芯片表面自組裝成穩定的抗體分子膜后，分別向流通池中通入不同菌液濃度的E. coli O157∶H7，然后通入AuNPs-PAb復合物進行檢測，整個實驗的SPR動力學曲線如圖5所示（以菌液濃度為108CFU/mL E. coli O157∶H7為例）。從圖5可明顯看出，通入PAb后立刻引起了SPR的響應信號，1 200 s基本達到平衡，SPR響應信號的變化（Δθ）值為82 mDeg，說明PAb已經被成功的固定在傳感器表面。當傳感器表面被PBS沖洗后，注入BSA也引起了SPR響應信號的變化，說明傳感器芯片表面的空位點已被BSA封閉。此時，注入E. coli O157∶H7引起的SPR響應信號的變化并不是很明顯，當E. coli O157∶H7完全與一抗結合后，再注入AuNPs-PAb的復合物時，引起了明顯的SPR響應信號的變化（注入AuNPs-PAb前的基線與注入AuNPs-PAb后響應信號經過高峰平臺期后下降并穩定的基線的差值），可明顯看出粒徑為17.79 nm的AuNPs標記二抗產生的SPR響應信號改變值最大，其次分別為粒徑34.05 nm和28.22 nm的AuNPs，這主要是由于AuNPs的比表面積增大了PAb的承載量，使復合物的折射率明顯增大及AuNPs的表面等離子體子（surface plasmons，SP）與金膜本身的SP發生了耦合的原因。待反應完成之后通入10 mmol/L NaOH使傳感器表面再生。

圖 6 3種粒徑檢測不同濃度E. coli O157∶H7的工作曲線Fig.6 Working curves for detecting different concentrations of E. coli O157∶H7 based on different sizes of AuNPs

如圖6所示，隨著E. coli O157∶H7濃度的增加，SPR響應的變化值也隨之增加，17.79 nm AuNPs增加SPR響應信號的變化值最為明顯，其次為34.05 nm，最后為28.22 nm，與圖5所示結果一致。當E. coli O157∶H7的濃度為108CFU/mL，粒徑分別為17.79、28.22 nm和34.05 nm的AuNPs標記二抗所引起的SPR響應信號的變化值分別為17.415、7.2373 mDeg和9.9403 mDeg，相對標準偏差分別為8.019%、7.723%和9.306%。這表明，檢測相同濃度的E. coli O157∶H7，17.79 nm AuNPs增強SPR的效果幾乎是28.22 nm和34.05 nm的AuNPs的2 倍。而且E. coli O157∶H7的濃度越大，17.79 nm AuNPs增強SPR的效果越強，而28.22 nm和34.05 nm的增強效果趨于平緩，當E. coli O157∶H7的濃度為1015CFU/mL時，兩者產生的SPR信號基本差不多。

圖 7 17.79 nm AuNPs檢測不同濃度E. coli O157∶H7的線性關系曲線Fig.7 Linear relationship curve of SPR assay for detection of E. coli O157∶H7 at different concentrations using 17.79 nm AuNPs

一般來說，在一定的粒徑范圍內，隨著AuNPs粒徑的增加，SPR響應信號也隨之增強。Zeng Shuwen等[19]系統地研究了AuNPs粒徑對于SPR響應信號的影響規律，研究表明當AuNPs的粒徑小于40 nm時，SPR響應信號隨著粒徑的增大而增加；當AuNPs粒徑大于40 nm時，SPR響應信號隨著粒徑的增大反而減小。而本實驗獲得的AuNPs標記二抗增強SPR響應信號的最佳粒徑為17.79 nm，其次是34.05 nm，最后為28.22 nm。這或許是以下兩個原因導致的綜合效應，一是由于粒徑較大的AuNPs被PAb包被后，導致AuNPs-PAb復合物粒徑更大，當AuNPs-PAb復合物與芯片表面的E. coli O157∶H7結合時，導致空間位阻的效應更明顯；二是由于E. coli O157∶H7本身也比較大（0.5～1.5 μm），當粒徑較大的AuNPs-PAb復合物與其結合后，使得傳感器表面的介質膜厚度比較大，導致SPR靈敏度下降[20]。圖7是增強效果最佳粒徑的AuNPs（17.79 nm）檢測E. coli O157∶H7的線性關系曲線，其最低可檢測到的濃度為10 CFU/mL，線性范圍為10～1010CFU/mL，相關系數為0.991 4，線性回歸方程為Y=2.037 17X＋1.652 22。

2.4 實際樣品加標回收率

應用17.79 nm的AuNPs采用同樣的方法進行了實際樣品的加標回收率實驗。為了保證檢測的準確性，樣品經長時間的烘干處理，確認其無微生物存活后，進行加標實驗。實際樣品中的E. coli O157∶H7加標量是106CFU/mL，SPR響應信號的變化值是18.284 mDeg，同濃度的E. coli O157∶H7標準品的SPR響應信號的變化值為16.603 mDeg，其加標回收率為110.12%，相對標準偏差為1.37%，說明該方法的準確度高、重復性好。

3 結 論

本實驗采用檸檬酸三鈉還原法合成了3 種不同粒徑（17.79、28.22、34.05 nm）的AuNPs，并將不同粒徑的AuNPs標記E. coli O157∶H7的PAb制備的AuNPs-PAb復合物作為二抗，利用氨基偶聯的方法將PAb固定在傳感器表明作為一抗，采用三明治夾心法，應用雙通道SPR傳感器（一個通道作為參比通道）對E. coli O157∶H7進行了高靈敏的檢測，考察3 種粒徑的增強能力，篩選出增強效應最佳的粒徑為17.79 nm。此方法可明顯增強SPR的檢測靈敏度，且操作時間短、試劑用量少、靈敏度高。

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Detection of E. coli O157:H7 Based on Au Nanoparticles of Different Sizes Labeled Second Antibody Enhanced Surface Plasmon Resonance

YANG Yang, LI Rongzhuo, MAO Lugang, LIU Xia*
(Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Fo od Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) was detected by a sandwich method with Au nanoparticles (AuNPs) of different sizes labeled E. col i O157:H7 polyclonal antibody (PAb) as the second antibody and PAb immobilized on the sensor surface as the first anti body using a dual-channel surface plasmon resonance (SPR) sensor. The abil ities of second antibodies labeled with AuNPs of three different sizes to enhance SPR signal were compared. As a result, the optimal AuNPs size was found to be 17.79 nm and the minimum detectable concentration of E. coli O157:H7 was 10 CFU/mL.

AuNPs； E. coli O157:H7； surface plasmon resonance (SPR)； labeling； different particle sizes

S951.42

A

1002-6630（2015）08-0201-05

10.7506/spkx1002-6630-201508037

2014-07-18

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201375）；公益性行業（農業）科研專項（201303084）

楊陽（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與控制。E-mail：769968476@qq.com

*通信作者：劉霞（1976—），女，副教授，博士，研究方向為食品分析、食品營養與安全。E-mail：liuxiaspr@aliyun.com