穩(wěn)定同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定酒類中氨基甲酸乙酯

趙依芃，王宗義*，李德美，夏曉楠，姜懷璽，韓 濤

穩(wěn)定同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定酒類中氨基甲酸乙酯

趙依芃，王宗義*，李德美，夏曉楠，姜懷璽，韓 濤

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京北農(nóng)葡萄酒工程技術(shù)中心，北京 102206）

建立穩(wěn)定同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測定酒類中氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）新方法。酒樣加入EC-d5內(nèi)標(biāo)，微孔濾膜后直接進(jìn)樣，經(jīng)Waters XSELECT HSS T3 （2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色譜柱，80%的水（含0.1%乙酸）和20%的乙腈為流動相，0.2 mL/min等度洗脫分離，電噴霧正離子（ESI＋）多重反應(yīng)監(jiān)測模式質(zhì)譜檢測（EC-d5：m/z 94.9/63、94.9/44；EC：m/z 89.9/62、89.9/44）。結(jié)果表明，EC的檢出限和定量限分別不大于2 ng/mL和5 ng/mL，驗(yàn)證質(zhì)量濃度（5～500 ng/mL）范圍內(nèi)保持線性，r2= 0.999 8。回收率為92.4%～108.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.12%～8.65%（n=6）。實(shí)際應(yīng)用顯示，與冷藏（4 ℃）相比，葡萄酒置于室溫（21～28 ℃）長期貯藏可導(dǎo)致EC顯著升高；燙酒（95 ℃）可導(dǎo)致蒸餾酒和配制酒EC顯著升高。

氨基甲酸乙酯；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；酒；穩(wěn)定同位素稀釋

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中形成的一種2A類致癌物[1]，酒類樣品中普遍存在，且乙醇對其致癌性有促進(jìn)作用[2]。發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯主要由酵母降解精氨酸產(chǎn)生的尿素和乳酸菌降解精氨酸產(chǎn)生的瓜氨酸與乙醇自發(fā)反應(yīng)形成[3]。盡管我國目前尚未規(guī)定相關(guān)食品的安全限量值，但EC已成為酒類質(zhì)量安全重點(diǎn)關(guān)注的對象之一。

目前，關(guān)于酒類及相關(guān)樣品中EC的檢測方法，主要有氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[4-5]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS-MS）法[6-8]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[9-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS-MS）法[12-14]，也有免疫等相關(guān)方法的研究[15]，但尚未見成熟應(yīng)用。其中GC-MS和GC-MS-MS需要使用固相萃取（solid-phase extraction，SPE）[16-17]、固相微萃取（solid-phase micro-extractionSPME）[18]、頂空固相微萃取（headspace-solid-phase micro-extraction，HSSPME）[19-20]、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[21]和基質(zhì)固相分散萃取（matrix solid-phase dispersion extraction，MSPDE）[22-23]等樣品凈化技術(shù)，而HPLC和LC-MS-MS又需要進(jìn)行衍生化處理，樣品處理相對繁瑣費(fèi)時。最為簡單的方法是LC-MS-MS直接進(jìn)樣分析，但由于存在基質(zhì)效應(yīng)，不容易定量準(zhǔn)確，通常需要對樣品進(jìn)行約10 倍的稀釋以減輕基質(zhì)的離子抑制效應(yīng)，這樣又降低了方法檢出能力。本實(shí)驗(yàn)以EC-d5為內(nèi)標(biāo)克服基質(zhì)效應(yīng)，建立了酒類樣品的直接LC-MS-MS分析新方法，并進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，可滿足精確定量和大批量檢測的需要，為酒類的質(zhì)量監(jiān)測和控制提供一個簡便有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒（釀造酒）、白酒（蒸餾酒）、果酒（配制酒） 北京回龍觀地區(qū)超市。

甲醇（色譜級） 美國Burdick-Jackson公司；EC標(biāo)品 德國Dr. EHrenstorfer Gmbh公司；EC-d5標(biāo)品美國Cambridge Isotope Laboratories公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6410 Triple Quad LC-MS系統(tǒng)、化學(xué)工作站軟件B.02.01版 美國Agilent公司；Heal Force? Super Series NW超純水系統(tǒng) 上海Canrex分析儀器有限公司；MS3基本型渦旋混合器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 EC和EC-d5儲備液和中間工作液的配制

稱取10 mg EC-d5標(biāo)準(zhǔn)品于10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃保存。使用時用甲醇稀釋至10 μg/mL的工作液，4 ℃保存。同樣方法配制1 mg/mL EC儲備液，用甲醇分級稀釋儲備液獲得質(zhì)量濃度分別為1 000、100 ng/mL的EC中間工作液。

1.3.2 樣品和標(biāo)樣的制備

將酒樣搖勻，立即準(zhǔn)確取出2.00 mL于一個10 mL試管中，準(zhǔn)確加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋振蕩5 s，吸取1.00 mL過0.22 μm濾膜，待分析。

分別移取質(zhì)量濃度為1 μg/mL的EC工作液500、100、50.0、25.0 μL，質(zhì)量濃度為100 ng/mL的EC工作液100、50、20 μL于1.5 mL液相色譜進(jìn)樣瓶中，再依次加入25.0 μL 10 μg/mL的EC-d5內(nèi)標(biāo)工作液，用甲醇-水（2∶3，V/V）稀釋到1.0 mL刻度（由于內(nèi)標(biāo)使用的是相對質(zhì)量濃度，故不需要使用容量瓶準(zhǔn)確定容），獲得EC-d5質(zhì)量濃度為250 ng/mL，EC質(zhì)量濃度分別為500、100、50.0、25.0、10.0、5.0和2.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于建立工作曲線。

1.3.3 分析條件

1.3.3.1 LC條件

使用XSELECT HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），Zorbax Eclipse Plus-C18預(yù)柱（12.5 mm× 2.1 mm，5 μm）。流動相A為0.1%（V/V）乙酸水溶液，B為乙腈。A體積分?jǐn)?shù)80%，B體積分?jǐn)?shù)20%；流速0.2 mL/min；等度洗脫5 min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.3.2 MS條件

電噴霧電離源正離子模式（ESI＋），多反應(yīng)離子監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）方式檢測，MRM參數(shù)見表1。干燥氮?dú)鉁囟葹?20 ℃，流速10 L/min；霧化器壓力137 931 Pa（20 psi）；噴霧毛細(xì)管電壓4 000 V。

表 1 EC和EC-d5的MRM質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of multiple-reaction monitoring (MRM) for EC and EC-d5

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離與質(zhì)譜檢測條件的選擇

在乙腈-水流動相體系下考察了XSELECT HSS T3（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）、ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）、Poroshell 120 Phenyl Hexyl（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）和Venusil HILIC（2.1 mm×100 mm，5 μm）對EC的分離效果，發(fā)現(xiàn)以上色譜柱都對EC有一定程度的保留，都可用于EC的分離，其中Waters XSELECT HSS T3效果更好，有更高的柱效，本實(shí)驗(yàn)選擇了該色譜柱用于分析，由于只有一個目標(biāo)物，使用了較為簡單的等度洗脫，優(yōu)化的分離條件見1.3.3.1節(jié)。流動相中加入0.1%（V/V）的甲酸或乙酸有利于EC離子化，文獻(xiàn)[24]報道乙酸的效果更好，但在本實(shí)驗(yàn)條件下區(qū)別不明顯，本實(shí)驗(yàn)使用乙酸。

優(yōu)化的EC質(zhì)譜MRM檢測條件見表1。EC和EC-d5的二級特征離子分別為m/z 44和62與m/z 44和63，其中m/z 44是母離子脫乙氧基形成，豐度較小，m/z 62和63為脫羰基形成，豐度較大。通常確證一個化合物需要一個母離子的2個子離子都能被觀察到，本實(shí)驗(yàn)中EC質(zhì)量濃度過低時，離子對m/z 89.9/44的信號很弱，但離子對m/z 89.9/62的信號很強(qiáng)，且不受酒樣基質(zhì)的影響，特征明顯，因此仍可有效對EC進(jìn)行識別和定量分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脫溶劑氮?dú)鉁囟葘z測靈敏度有顯著影響，在考察的溫度范圍內(nèi)（120～350 ℃），隨溫度下降靈敏度顯著增強(qiáng)，這可能是由于低溫有利于增強(qiáng)EC的離子化效率所致，本實(shí)驗(yàn)使用120 ℃。典型MRM檢測色譜圖如圖1所示。

圖 1 典型樣品的MRM色譜圖Fig.1 Typical MRM chromatogram of ethyl carbamate

2.2 樣品前處理

酒類樣品基質(zhì)相對簡單，可利用LC-MS-MS的高選擇性和高靈敏性進(jìn)行直接進(jìn)樣分析，但基質(zhì)對電噴霧離子化的抑制效應(yīng)影響嚴(yán)重，不容易進(jìn)行準(zhǔn)確定量，或造成定量嚴(yán)重偏離。高倍稀釋樣品會減輕基質(zhì)效應(yīng)，但又會降低方法的檢出能力。使用EC-d5做內(nèi)標(biāo)，校正了基質(zhì)效應(yīng)，樣品不用稀釋，過濾后直接進(jìn)樣，保證了方法檢出能力，同時使樣品處理操作更為簡單、容易，定量可靠，同時降低了對人員熟練程度的要求。雖然EC-d5較為昂貴，但由于樣品的平均用量只有250 ng，對分析成本沒有明顯提高，有利于大批量樣品的監(jiān)測。

2.3 檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantifi cation，LOQ）、線性、準(zhǔn)確性和精密度

由于EC是一種內(nèi)源物質(zhì)，空白樣不易獲得，因此，用酒樣稀釋一系列質(zhì)量濃度的EC-d5進(jìn)樣評價，分別以3 倍和10 倍信噪比對LOD和LOQ進(jìn)行估測，本實(shí)驗(yàn)條件下EC的LOD和LOQ分別不大于2 ng/mL和5 ng/mL。方法的線性評價是參照酒樣EC的可能質(zhì)量濃度，通過進(jìn)樣分析一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行，在考察的EC質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（2～500 ng/mL，EC-d5為250 ng/mL），得回歸方程y = 0.956x＋0.020，r2= 0.999 8（式中：y和x分別為EC和EC-d5的響應(yīng)比和質(zhì)量濃度），表明在此考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性。

方法的準(zhǔn)確性和精密度評價，分別選擇釀造酒、蒸餾酒和配制酒的代表樣品進(jìn)行，結(jié)果見表2，回收率為92.4%～108.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.12%～8.65%，表明本方法有足夠的準(zhǔn)確度和精密度。

表 2 典型酒樣中EC測定的回收率（n=6）Table 2 Recoveries of EC in typical alcoholic beverages (n=6)

2.4 實(shí)際樣品的應(yīng)用

表 3 市售酒中EC的檢測結(jié)果Table 3 Results of EC content determined in alcoholic beverages

圖 2 兩種不同條件貯存葡萄酒的EC含量對比Fig.2 Comparison of EC contents in wine under two storage conditions

圖 3 燙酒時間對EC含量的影響Fig.3 Effect of heating time before drinking on the content of EC in alcoholic drinks

應(yīng)用本方法對市購發(fā)酵酒、蒸餾酒、配制酒各6 個，進(jìn)行EC含量檢測，結(jié)果見表3。此結(jié)果與石維妮等[25]的調(diào)研結(jié)果基本相似。其中葡萄酒購于2 a前，開封后取出部分于4 ℃冰箱密閉貯存，原樣重新封口后室溫貯存，應(yīng)用本方法對2 種貯存方法的葡萄酒進(jìn)行分析，EC含量的對比見圖2，結(jié)果表明室溫貯存的葡萄酒EC含量顯著升高。在我國北方，特別是冬季，飲酒時有燙酒的習(xí)慣，應(yīng)用本方法比較了蒸餾酒和配制酒在95 ℃燙酒溫度條件下EC含量隨時間的變化情況，以及燙酒時加蓋密封與否的影響，見圖3，結(jié)果表明燙酒使蒸餾酒和配制酒中EC含量均隨時間延長而升高，但當(dāng)燙酒時間超過40 min后，不加蓋密封組的EC有下降的趨勢，這可能是EC從酒中揮發(fā)的緣故。因此，建議燙酒時加熱時間不宜過長，且盡量不要加蓋密封。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了酒類樣品中EC的穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測定方法，具有操作簡單、準(zhǔn)確實(shí)用、節(jié)約成本、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，特別適合大批量酒類樣品中EC的定性和定量篩查和評價，為酒類EC的監(jiān)測、生產(chǎn)控制和相關(guān)工藝的研究提供了一個有效手段。實(shí)際應(yīng)用顯示，葡萄酒低溫冷藏可顯著抑制EC含量增長；燙酒可使蒸餾酒和配制酒中EC含量升高。

[1] IARC. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans[EB/OL]. http:// monographs. iarc.Fr / ENG / Monographs / vol96/index.php. 2010.

[2] MILLER Y E, DWYER N, KEITH R L, et al. Induction of a high incidence of lung tumors in C57BL/6 mice with multiple ethyl carbamate injection[J]. Cancer Letters, 2003, 198(2): 139-144.

[3] 羅蘇僅, 白衛(wèi)東, 趙文紅, 等. 發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯形成的代謝途徑及控制[J]. 中國釀造, 2013, 32(9): 9-12.

[4] 包志華, 娜仁高娃, 馬俊華. 氣相色譜-質(zhì)譜法測定白酒中氨基甲酸乙酯的分析[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2013(12): 64-68.

[5] 吉林省衛(wèi)生廳. DBS 22/003—2013飲料酒中氨基甲酸乙酯的測定:氣相色譜-質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2012.

[6] BAFFAJúNíOR J C, MENDONCA R C S, de TEIXEIRA J M A, et al. Ethyl-carbamate determination by gas chromatography-mass spectrometry at different stages of production of a traditional Brazilian spirit[J]. Food Chemistry, 2011, 129(4): 1383-1387.

[7] 徐小民, 何華麗, 阮瑜迪, 等. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃酒和醬油中氨基甲酸乙酯[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2013, 4(3): 705-709.

[8] LACHENMEIER D W, NERLICH U, KUBALLA T. Automated determination of ethyl carbamate in stone-fruit spirits using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1108(1): 116-120.

[9] MADRERA R R, VALLES B S. Determination of ethyl carbamate in cider spirits by HPLC-FLD[J]. Food Control, 2009, 20(2): 139-143.

[10] AJTONY Z, SZOBOSZLAI N, BENCS L, et al. Determination of ethyl carbamate in wine by high performance liquid chromatography[J]. Food Chemistry, 2013, 141(2): 1301-1305.

[11] ZHANG Jian, LIU Guoxin, ZHANG Ying, et al. Simultaneous determination of ethyl carbamate and urea in alcoholic beverages by high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(13): 2797-2802.

[12] TAN Wenyuan, YUAN Dong, FU Dayou, et al. Determination of methyl carbamate and ethyl carbamate in white liquor by GC-MS[J]. Food Science, 2011, 32(16): 305-307.

[13] DEáK E, GYEPES A, STEFANOVíTS-BáNYAí é, et al. Determination of ethyl carbamate in pálinka spirits by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry after derivatization[J]. Food Research International, 2010, 43: 2452-2455.

[14] 朱懷遠(yuǎn), 莊亞東, 劉獻(xiàn)軍, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定卷煙主流煙氣中的氨基甲酸乙酯[J]. 分析測試學(xué)報, 2013, 32(8): 963-967.

[15] 郭明, 周偉, 周珊, 等. 新型氨基甲酸乙酯人工抗原的分析表征方法研究[J]. 分析化學(xué), 2013, 41(2): 193-198.

[16] 諸葛慶, 李博斌, 江濤, 等. 固相萃取高效液相色譜法測定黃酒中氨基甲酸乙酯[J]. 釀酒科技, 2012(1): 112-115.

[17] UBEDA C, BALSERA C, TRONCOSO A M, et al. Validation of an analytical method for the determination of ethyl carbamate in vinegars[J]. Talanta, 2012, 89: 178-182.

[18] de RESENDE MACHADO A M, das GRACAS CARDOSO M, EMíDIO E S, et al. Experimental design methodology to optimize the solid phase microextraction procedure prior to GC/MS determination of ethyl carbamate in samples of homemade cacha?a[J]. Analytical Letters, 2012, 45: 1143-1155.

[19] YE Changwen, ZHANG Xuena, GAO Yuanli, et al. Multiple headspace solid-phase microextraction after matrix modification for avoiding matrix effect in the determination of ethyl carbamate in bread[J]. Analytica Chimica Acta, 2012, 710: 75-80.

[20] 劉俊, 徐巖, 陳雙, 等. 頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)快速測定黃酒中氨基甲酸乙酯的方法研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(4): 60-69.

[21] 浙江進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局. SN 0285—2012 出口酒類中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法: 氣相色譜-質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2012.

[22] 周勇, 綦艷, 朱文亮, 等. 基質(zhì)固相分散-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定焙烤食品中的氨基甲酸乙酯[J]. 食品科技, 2013, 38(2): 307-310

[23] LECA J M, PEREIRA V, PEREIRA A C, et al. Rapid and sensitive methodology for determination of ethyl carbamate in fortifi ed wines using microextraction by packed sorbentand gas chromatography with mass spectrometric detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2014, 811: 29-35.

[24] 王麗娟, 柯潤輝, 王冰, 等. 超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定黃酒和葡萄酒中氨基甲酸乙酯[J]. 色譜, 2012, 30(9): 903-907.

[25] 石維妮, 劉曉毅, 趙玉琪, 等. 發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯含量調(diào)研[J].中國釀造, 2009, 27(11): 124-126.

Direct Determination of Ethyl Carbamate in Alcoholic Drinks by Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Yipeng, WANG Zongyi*, LI Demei, XIA Xiaonan, JIANG Huaixi, HAN Tao
(Beijing Capital Wine Technology and Engineering Center, Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control for Spoilage Organisms and Pesticides, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Sciences and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

A new method was established for direct determination of ethyl carbamate (EC) in alcoholic beverages by stable isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. After being spiked with EC-d5 and fi ltered with micropore filters, the samples were directly injected. The chromatographic separation was carried out on a Waters XSELECT HSS T3 column (2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) with a mobile phase of 80% water containing 0.1% (V/V) acetic acid and 20% acetonitrile in an isocratic elution mode at a fl ow rate of 0.2 mL/min. The mass spectrometry detection was performed by positive electrospray ionization (ESI+) and monitored in a multiple reaction monitoring (MRM) mode (m/z 94.9/63 and 94.9/44 for EC-d5; m/z 89.9/62 and 89.9/44 for EC). The limit of detection (LOD) was lower than 2 ng/mL and the limit of quantifi cation (LOQ) was lower than 5 ng/mL. The calibration curve showed good linearity in the range of 5–500 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 8. The spiked recoveries of EC ranged from 92.4% to 108.5%, and the relative standard deviations (RSDs) were 3.12%–8.65% (n = 6). EC content increased signifi cantly when wine was stored at room temperatures (21–28 ℃) than at 4 ℃ as determined by the proposed method. Heating (at 95 ℃) before drinking resulted in signifi cantly increased levels of EC content in distilled spirits and mixed alcoholic drinks.

ethyl carbamate; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; alcoholic drink; isotope dilution

O657.7

A

1002-6630（2015）08-0220-05

10.7506/spkx1002-6630-201508041

2014-07-26

北京市教育委員會項(xiàng)目（KM201310020009；PXM2014-014207-000001）

趙依芃（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。E-mail：litnn77622@sina.com

*通信作者：王宗義（1970—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)。E-mail：wangzongyi001@sina.com