鹽堿脅迫對紫花苜蓿根系Na+、K+離子流速的影響

鹽堿脅迫對紫花苜蓿根系Na+、K+離子流速的影響

郭鵬，張萬筠，鮑雅靜

(大連民族大學 環境與資源學院， 遼寧 大連 116605)

摘要：中國鹽堿地形成，大部分與土壤中碳酸鹽的累計有關，因而堿化度普遍較高。在鹽堿地再利用過程中，簡單說，可以分為輕鹽堿地、中度鹽堿地和重鹽堿地。利用NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34種鹽，按不同比例配比，人工模擬鹽堿地中輕鹽堿地鹽堿度、中度鹽堿地鹽堿度和重鹽堿地鹽堿度。選用耐鹽苜蓿品種金皇后、中度耐鹽苜蓿品種阿爾岡金、敏感苜蓿品種敖漢，分別進行鹽堿脅迫實驗；通過非損傷微測技術檢測苜蓿根系Na+ 、K+離子流變化，比較輕鹽堿度、中度鹽堿度和重鹽堿度脅迫下3個耐鹽苜蓿品種的離子流速差異。結果顯示：在鹽堿脅迫下，耐鹽堿品種金皇后Na+離子流速外流速度比中度耐鹽品種阿爾岡金要高，且均表現為外流；敏感品種敖漢在中度鹽堿環境下由外流轉變為內流，并出現萎蔫跡象。3個苜蓿品種的K+離子流速都發生變化，表現為外流，但流速變化各不相同且無明顯的規律性。所以，在鹽堿抗逆性中紫花苜蓿可以通過Na+離子流速控制來適應鹽堿環境。

關鍵詞：鹽堿地；紫花苜蓿；鹽堿脅迫；非損傷微測技術；離子流速

收稿日期：2015-06-25；最后修回日期：2015-07-01

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31170168)；國家星火計劃資助項目(2012GH531899，2013GA651006)；遼寧省科技計劃項目(2011209001)；遼寧省高等學校優秀科技人才項目(LR2013055)。

作者簡介：郭鵬(1980-)，男，山東青島人，講師，博士，主要從事植物抗逆學研究。

文章編號：1009-315X(2015)05-0439-06

中圖分類號：S541.9文獻標志碼：A

Influence of Salt Stress on the Ion Flow Velocity of the Na+and K+ion in Alfalfa Root

GUO Peng, ZHANG Wan-jun, BAO Ya-jing

(College of Enviroment and Resources, Dalian Nationlities University,Dalian Liaoning 116605, China )

Abstract:The formation of saline is relation to carbonate’s cumulative, so the degree of alkalisation is generally higher in the saline. Simply put, the saline can be divided into light , moderate and heavy saline salinity in the use process. In this study, we use NaCl, Na2SO4, NaHCO3, Na2CO3 to artificially simulate the light, moderate and heavy saline according to the different proportions. Meanwhile, we select the salt-tolerant alfalfa variety: God Empress, moderately tolerant alfalfa variety: Algonquin, sensitive alfalfa variety: Aohan to conduct saline stress experiments. Ion flow variation is detected by using Non-invasive Micro-test Technique for the Na +, K + ion in the alfalfa roots, and the Na +, K + ionic velocity differentia of God Empress, Algonquin, Aohanare under light salinity, moderate salinity and heavysalinity stress is compared. The results show that: under salinity stress, God Empress Na + ion velocity rate is faster than Algonquin, and they show outflows; Aohan under the moderate saline environment varies from outflow to internal flow, and shows signs of wilting. The three varieties alfalfa of K+ ion velocity all chang, but the variation of the ion velocity are not the same and without obvious regularity, and display outflow. Therefore, in the saline alkali tolerance, Alfalfa may adapt to the saline environment by controlling Na+ ion velocity.

Key words:saline; alfalfa; salinity stress; Non-invasive Micro-test Technique; ion flow velocity

干旱、鹽堿等非生物逆境脅迫時常嚴重影響植物的正常生長發育, 也是導致農作物減產的重要環境因素[1]。植物在長期的進化過程中, 在分子、細胞和生理生化水平上均已形成應對外界不良環境的一系列應答機制[2]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv)是世界上分布最廣泛的豆科牧草，也是中國種植面積最大的飼草飼料作物，在發展畜牧業生產、改良土壤和保護生態環境等方面發揮著重要的經濟、生態和社會效益[3]。目前土壤鹽堿化已成為制約中國農業發展的重要問題，并影響到生態系統的穩定和生物的多樣性[4-6]。紫花苜蓿作為一種非常重要的豆科牧草，培育抗鹽、抗堿的苜蓿新品種具有重要的現實迫切性。

本實驗利用NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34種鹽,按不同比例配比,人工模擬鹽堿地中輕鹽堿地鹽堿度、中度鹽堿地鹽堿度和重鹽堿地鹽堿度，選用耐鹽苜蓿品種金皇后、中度耐鹽苜蓿品種阿爾岡金、敏感苜蓿品種敖漢分別進行鹽堿脅迫實驗；通過非損傷微測技術檢測苜蓿根系Na+、K+離子流速變化，比較輕鹽堿度、中度鹽堿度和重鹽堿度脅迫下耐鹽苜蓿品種的差異，該研究可為紫花苜蓿耐鹽堿育種研究提供新的理論支持。

1材料與方法

1.1　材料

耐鹽型紫花苜蓿品種：金皇后(God Empress)；中度耐鹽型紫花苜蓿品種：阿爾岡金(Algonquin)；鹽敏感型紫花苜蓿品種：敖漢(Aohan)。

1.2　材料培養

1.2.1苜蓿種子萌發

種子用3 %的次氯酸鈉溶液消毒15 min，75 %的酒精清洗2~3次。蒸餾水浸種20~24 h后，挑選萌發一致的種子置于培養皿中，培養皿中鋪墊單層濾紙，用蒸餾水浸濕濾紙，每天置換濾紙，培養3~5 d后移植。

1.2.2鹽堿混合脅迫處理

鹽堿地利用的簡單分類：輕度鹽堿地pH值為7.1~8.5，中度鹽堿地pH值為8.5~9.5，重度鹽堿地pH值為9.5以上。實驗中用A1組、A2組、A3組分別表示輕度鹽堿地(A1組:V(NaCl):V(Na2SO4):V(NaHCO3):V(Na2CO3)=1:2:1:0,pH值7.77±0.104)、中度鹽堿地(A2組:V(NaCl):V(Na2SO4):V(NaHCO3):V(Na2CO3)=1:9:9:1,pH值8.80±0.043)、重度鹽堿地(A3組: V(NaCl):V(Na2SO4):V(NaHCO3):V(Na2CO3)=1:1:1:1,pH值9.84±0.013)。人工模擬鹽堿地鹽堿濃度混合比見表1。

表1　人工模擬鹽堿地鹽堿濃度混合物質的量　mol

將萌發一致的紫花苜蓿幼苗移栽花盆，每盆5苗，3次重復， 先用蒸餾水澆灌，一次澆透，每隔2 d澆一次。緩苗30 d后，用不同鹽堿混合溶液進行混合脅迫，每盆80 mL鹽堿混合液,分4次澆灌，每次間隔2 d。每隔24 h用PHS-3C型數字pH計測定流出液的電導率、pH值，連續測定至pH值基本不變為止(盆下流出液體的pH值、鹽分濃度與實驗設計的要一致)。對照組不處理。處理共計10 d。鹽堿脅迫濃度設置空白組A0(正常鹽堿度)、A1組(輕度鹽堿度)、A2組(中度鹽堿度)、A3組(重度鹽堿度)。

1.3　方法

1.3.1Na+離子流速檢測

Na+離子流速檢測利用非損傷微測系統(YoungerUSA (Xuyue Beijing) NMT Service Center)完成。以非損傷性掃描離子選擇電極技術獲取進出紫花苜蓿根系的Na+離子濃度( mmol·L-1級)、流速及流向信息。離子選擇性電極由玻璃微電極、Ag/AgCl導線、電解質及液態離子交換劑( LIX) 組成。該電極在待測離子濃度梯度中以已知距dx進行兩點測量， 可測得兩點的電壓分別為V1、V2,再通過已知的該電極的電壓/濃度校正曲線計算離子的濃度。通過物理學中的離子/分子擴散定律的數學公式：J0=-D *dc/dx，可獲得該離子的流動速率(pmol·cm-2·s-1)。式中，D 為離子/分子特異的擴散常數(cm-2·s-1)。本實驗所用微電極均為旭月公司提供。Na+選擇性微電極前端灌充250 Lm Na+離子的液態交換劑液柱，后端灌充有15～50 mm 左右的電解液柱( 100 mmol·L-1NaCl)，將電極固定器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸。固體電極作為參比電極。玻璃微電極需要校正后使用， 校正斜率在58±3范圍內為合格電極，可用于檢測。校正液中Na+的濃度分別設置為0.1和1 mmol·L-1，其他成分與測試液相同。

幼苗在測量前10 min轉移到裝有測試液(0.1mmol CaCl2，0.1mmol KCl，0.5 mmol NaCl，0.2 mmol Na2SO4，0.3 mmol MES，pH值5.8)的測試盒中平衡。測試時，將幼苗根系置于測試液中，用小玻璃塊將測試部位固定壓好。測量區域是位于距離根尖300~400 um的根系根毛區。將電極尖端置于距離根表10 Lm處作為原點，在垂直于根表面的方向進行兩點移動，測量兩點電壓差，兩點移動距離為30 Lm(如圖1)。每個樣品穩定測量10 min。

圖1　非損傷性掃描離子選擇電極測試圖 ① 微電極；②根尖端距離；③ 電極移動方向。

所測結果利用校正得到的Nernst slope將測量兩點之間電壓差換算成離子濃度差。再將結果代入Fickcs第一擴散定律，就可獲得該離子的流動速率(pmol·cm-2·s-1)。在試驗中，流速計算利用Mage flux 軟件(YoungerUSA Sc.i & Tech. Corp.,USA)完成。在凈離子流的計算過程中，基本上認為根表面離子流運動符合圓柱擴散幾何模型。

1.3.2K+離子流速檢測

K+離子流速的測定方法與Na+離子流速的測定方法相同。

2結果與分析

2.1　鹽堿脅迫對紫花苜蓿根系Na +吸收的影響

鹽堿脅迫后紫花苜蓿根系Na+平均流速及流向如圖2。與對照組(A0)相比，在鹽堿混合脅迫下鹽敏感品種敖漢Na+離子流速成下降趨勢，在輕度鹽堿度表現為外流，在中度鹽堿度和重度鹽堿度轉變為內流；中度耐鹽品種阿爾岡金由對照組的內流轉換為外流，在輕度鹽堿度和中度鹽堿度離子流速有上漲的趨勢，在重度鹽堿度時離子流速回落；耐鹽品種金皇后也是由內流轉換為外流，但是流速變化幅度較大，在中度鹽堿度時可達到818 pmol· cm-2·s-1，而在重度鹽堿度時流速急劇下降，但是外流速度還是高于阿爾岡金。從總體上分析，敖漢在鹽堿脅迫下Na+離子流速呈現下降趨勢，在中度鹽堿度脅迫時離子由外流轉變為內流，阿爾岡金與金皇后離子流速呈現上升的趨勢，但是在重度鹽堿度時Na+離子流速有所回落。以上結果顯示，耐鹽性強的紫花苜蓿在鹽堿脅迫下Na+離子流速顯著大于敏感品種，這說明，在鹽堿環境下耐鹽性強的紫花苜蓿品種可以通過提高Na+的外流速度來適應鹽堿環境。

圖2　鹽堿脅迫后紫花苜蓿根系Na +平均流速及流向

比較相同濃度下鹽堿脅迫3個品種Na+離子流速。在正常濃度下敖漢Na+離子流速表現為外流，最高離子流速可達875 pmol· cm-2·s-1，阿爾岡金和金皇后表現為內流流速大約在256 pmol· cm-2·s-1和132 pmol· cm-2·s-1，如圖3(a)；在輕度鹽堿度中3個品種基本表現為外流，金皇后外流速度最快，最高流速為1 400 pmol·cm-2·s-1，敖漢和阿爾岡金相對較低，如圖3(b)；在中度鹽堿度下，3個品種流速變化都比較明顯，Na+外流速度都有所增加，但是阿爾岡金變化幅度最小，如圖3(c)；在重度鹽堿度下，敖漢Na+開始內流，阿爾岡金外流速度也大幅度下降，但還是表現為外流，而金皇后外流速度也有所減小，幅度變化不大，只有30 pmol·cm-2·s-1左右，如圖3(d)。以上結果顯示，在不同鹽堿環境下不同品種的紫花苜蓿在排鈉速度的穩定性不同，金皇后在各個鹽堿環境下的Na+離子流速最為穩定(重度鹽堿度除外，pH值和碳酸根濃度過高影響紫花苜蓿正常生長)。

(a)

(b)

(c)

(d)

2.2　鹽堿脅迫對紫花苜蓿根系K +吸收的影響

在鹽堿脅迫下3個紫花苜蓿品種的K+離子平均流速都表現為外流，平均流速變化各不相同，與對照組(A0)相比，敖漢在輕度鹽堿下K+平均流速有所增加外，在中度鹽堿環境和重度鹽堿環境中基本保持不變；阿爾岡金在對照組中表現為K+平均流速高速外流，在鹽堿脅迫下K+平均流速都有所變化，輕度鹽堿環境下K+平均流速急劇下降，中度鹽堿環境下K+平均流速回升，在重度鹽堿環境下又急劇下降，但還是高于輕度鹽堿環境的K+平均流速；金皇后的K+平均流速變化趨勢與阿爾岡金類似，只是在輕度鹽堿環境下K+平均流速下降更為急劇(如圖4)。結果顯示，3個品種在鹽堿脅迫下K+離子平均流速都表現為外流，平均離子流速變化各不相同，中度耐鹽品種阿爾岡金和耐鹽品種金皇后的變化趨勢類似。

圖4　鹽堿脅迫后紫花苜蓿根系K +平均流速及流向

比較相同濃度下鹽堿脅迫3個品種K+離子流速。在3種鹽堿環境K+離子流速均表現為外流，除在輕度鹽堿環境外金皇后離子流速都比其他兩個品種流速要高，最高流速可達325 pmol·cm-2·s-1(如圖5)。在3個不同鹽堿環境下，敖漢、阿爾岡金和金皇后的K+離子流速變化各不相同，在輕度鹽堿環境中敖漢K+離子流速增加，在中度鹽堿環境下又回復平穩，與對照組基本一致，而在重度鹽堿下K+離子流速波動幅度明顯變大；阿爾岡金和金皇后的K+離子流速雖然各有變化，但變化幅度比較平穩，沒有較大的波動。

(a)

(b)

(c)

(d)

2.3　鹽堿脅迫對紫花苜蓿根系Na +、K +離子流速綜合分析

Na+、K+合并后的離子流速圖如圖6。可以觀察到，鹽堿脅迫下紫花苜蓿K+離子流速都表現為外流作用，Na+離子流速變化較大。在對照組中，除敖漢Na+離子流速為外流外其他都表現為內流，鹽堿脅迫后Na+流速迅速變化，由內流轉變為外流，而K+離子流速迅速增加。敖漢在輕度鹽堿脅迫下Na+離子流速急劇減小為6.95 pmol·cm-2·s-1，K+離子流速卻隨之增加；在中度鹽堿和重度鹽堿脅迫下Na+、K+離子流速都有回落，甚至出現Na+內流的情況，此時與敖漢在此濃度脅迫下活力降低，出現萎蔫的情況一致。阿爾岡金在鹽堿脅迫下Na+由內流轉變為外流，離子流速隨著鹽堿度增加略有上漲的趨勢，而K+外流速度先下降有回升的趨勢。與阿爾岡金類似，金皇后K+外流速度也出現回落或回升的趨勢，而Na+離子流速變化明顯特別是在輕度鹽堿度和重度鹽堿度中，最高流速可達818.03 pmol· cm-2·s-1。從Na+、K+疊加圖可以看出，在鹽堿脅迫下紫花苜蓿可以通過拒Na+方式適應鹽堿環境。

圖6　鹽堿脅迫后紫花苜蓿Na +/K +合并離子流速及流向

圖6數據顯示，紫花苜蓿在鹽堿脅迫下對K+離子流速變化有一定的影響作用，但K+離子流速變化規律無跡可尋或不成規律，對于紫花苜蓿耐鹽堿性強弱是否與K+離子流速有關還需進一步研究。

3討論

通常在鹽堿脅迫下，植物生長緩慢，代謝受到抑制，嚴重時出現鹽斑，葉子萎蔫，甚至死亡。現有研究表明，與大多數甜土植物一樣，紫花苜蓿屬于拒Na+植物，而且其拒Na+能力與耐鹽性密切相關[7-11]。鹽脅迫下，雖然各紫花苜蓿品種地上部Na+含量都有所上升，但與耐鹽品種相比，鹽敏感型品種地上部Na+含量更高[12-14]。地上部較高的Na+/ K+是造成紫花苜蓿鹽害的主要原因[15-18]。Bao等[19]研究表明，地上部Na+/ K+與品種的耐鹽性呈負相關關系。因此，在鹽脅迫下維持較低的Na+/ K+有助于減輕鹽分對紫花苜蓿植株，特別是其地上部的傷害，從而維持其正常生長。王小山等[20]研究表明，中性鹽和堿性鹽脅迫后，苜蓿根、莖、葉的Na+含量升高，堿性鹽處理的根、莖 Na+含量顯著高于中性鹽處理，中性鹽和堿性鹽脅迫后，堿性鹽脅迫下的 Na+/ K+值高于中性鹽脅迫；堿性鹽脅迫使Na+/Mg+比值高于中性鹽脅迫，堿性鹽脅迫抑制根對Al+的吸收，但對其向莖和葉中運輸則影響不大。混合堿性鹽脅迫弱化了苜蓿對Na+吸收與運輸的控制，增強了Na+的毒害，中性、堿性混合鹽脅迫條件下，重要養分離子在苜蓿植株根、莖、葉中的含量存在差異，進一步說明紫花苜蓿對中性和堿性鹽脅迫的適應機制不同，這可能與溶液高 pH值和高濃度的碳酸根存在有關。

4結論

(1)在輕度、中度、重度鹽堿濃度脅迫下，敏感型紫花苜蓿品種敖漢Na+離子流速逐漸下降，在中度鹽堿環境下由外流轉變為內流；中度耐鹽紫花苜蓿品種阿爾岡金Na+離子流速呈上升趨勢，由對照組的內流轉變為外流，且外流速度在輕度、中度鹽堿環境下逐漸上升，在重度鹽堿環境下有回落。

(2)耐鹽紫花苜蓿品種金皇后的Na+離子流速與中度耐鹽品種阿爾岡金類似，在輕度和中度鹽堿環境下Na+離子流速逐漸上升，在重度鹽堿環境下回落，導致回落的原因可能是脅迫溶液的pH值過高和高濃度的碳酸根存在有關。從總體上分析，在鹽堿脅迫下，敏感型品種敖漢Na+離子流速逐漸下降；中度耐鹽品種阿爾岡金Na+離子流速逐漸升高；耐鹽品種金皇后Na+離子流速逐漸升高，但增幅比中度耐鹽品種阿爾岡金要大。所以，紫花苜蓿在一定pH值和碳酸根濃度的鹽堿環境下，可通過控制Na+離子流速維持正常的生長。

(3)在不同鹽堿濃度的脅迫下，3種紫花苜蓿品種的K+離子流速始終表現為外流，且流速均發生變化。由于鹽堿脅迫濃度梯度設置，無法體現K+離子流速變化是否與鹽堿度相關，關于紫花苜蓿在鹽堿脅迫下K+離子流速與耐鹽堿性的相關性還需做進一步研究。

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(責任編輯鄒永紅)