豬POU1F1和GH基因及其多態性的研究進展

孔偉林，壽奎均，陳成紅，黃 強，黃學超

（1.浙江省諸暨市王家井鎮動物衛生監督站，浙江 諸暨 311813；2.浙江省諸暨市同山鎮動物衛生監督站，浙江 諸暨 311808）；3.浙江省諸暨市畜牧獸醫局，浙江 諸暨 311800；4.浙江省諸暨市國偉禽業有限公司，浙江 諸暨 311813）

近年來，國內外學者對豬POU1F1和GH基因做了一些基礎性研究，結果表明這兩個基因都是與動物生長相關的重要基因。本文對豬POU1F1和GH基因的研究概況進行了闡述。

1 POU1F1基因

垂體特異性轉錄因子（PIT-1）是POU結構域中幾種同源（異型）蛋白之一，目前已被正式命名為POU1F1[1]。該蛋白能夠調控生長激素、催乳素和促甲狀腺素的轉錄和表達，對動物生長發育過程起重要的調節作用。目前已在多種動物上發現其多態性與生長性狀相關。劉波、陳宏等在秦川牛及其雜種牛的四個群體中檢測POU1F1的酶切多態性，發現AB、BB基因型個體在胸圍、十字部高指標上顯著高于群體AA型個體（P＜0.05），可作為秦川牛體尺指標（胸圍、十字部高）的候選基因之一[2]。龐瑾等在7個中國地方豬品種和3個國外豬品種中進行了POU1F1基因的多態性分析，結果在7個地方品種中檢測到第4外顯子上有一個突變，沒有氨基酸變化；在3個國外品種中檢測到1個Rsa I限制性內切酶的多態酶切位點[3]。由此看來，POU1F1基因標記的多態信息含量較高，遺傳變異較大，分析POU1F1基因多態性進而探討其對生長的調節作用，對于提高豬的產肉性能具有重要的意義。

1.1 POU1F1的生物學功能 POU1F1蛋白是動物垂體前葉特異性表達的一種具有重要功能的轉錄因子[4]，該蛋白對垂體前葉胚胎發育以及生長激素（GH）、催乳素（PRL）和促甲狀腺素亞β單位（TSHβ）基因的表達起決定性作用。在多種垂體激素缺乏而導致侏儒的鼠和人類中，均可發現POU1F1基因活性的喪失。POU1F1在胚胎期率先表達，提示POU1F1蛋白對于胚胎期垂體前葉細胞分化以及GH、PRL和TSH細胞的發育有重要作用。POU1F1基因突變可以導致垂體發育萎縮，使GH、PRL和TSHβ分泌完全缺乏，從而導致矮小現象出現。所以，POU1F1蛋白對于垂體細胞的形成和垂體細胞的增生具有重要作用。POU1F1蛋白與垂體中的 PRL、GH、TSHβ 基因及POU1F1自身的啟動子結合，調節這些基因的轉錄和表達，進而對動物的生長發育、繁殖和免疫等起重要作用。

1.2 POU1F1基因的結構與定位 POU1F1基因是POU結構域基因家族的成員之一，而POU結構域因子家族是一類轉錄調節因子，POU基因家族分成六大類，不同類別的成員行使不同的功能。POU1F1蛋白有3個重要的結構域：N端轉錄激活區、POU特異區（ POU-SD）和 POU 同源區（ POU-HD）[5]。POU1F1蛋白對于靶基因的轉錄激活作用依靠此N端轉錄激活區，而POU-SD和POU-HD的主要功能是識別靶DNA的特異順序并與之呈高親和力的結合，從而啟動靶DNA的轉錄。豬POU1F1基因被發現定位于13號染色體上的q46區域[6]，已知其cDNA序列全長876bp，編碼292個氨基酸，包含6個外顯子，約含60個氨基酸。豬POU1F1基因序列與其他已知POU1F1序列的哺乳動物的同源性達95%，氨基酸序列上的差別僅出現在氨基端區域，POU-SD與POU-HD區域則高度保守。

Yu T P等[7]以豬POU1F1基因cDNA片段為探針，克隆了全長為2695bp的POU1F1基因組區域并進行測序，隨后Tuggle CK等、Nicolas、Chung等也對POU1F1基因組區域進行了克隆測序，但他們所得的DNA序列彼此并不一致，而且在POU-SD和POUHD區域中均有差異。但據江蘇省動物遺傳育種重點實驗室最近的研究驗證，發現Yu T P等的這段2695 bp的POU1F1基因組序列是最具科學性和說服力的。

1.3 豬POU1F1基因的多態性研究 美國的Tuggle等早在1993年就開始了POU1F1基因多態性與豬生長及胴體性狀的關系研究，研究結果是在中國豬種梅山豬的POU1F1基因中發現了一個Bam HI多態基因座，BB基因型豬有相對較大的初生重及平均背膘厚，但在美國豬種中并沒有發現同樣的多態基因座。為了進一步研究POU1F1的多態性與豬生長和胴體性狀的關系，Yu T P等選用由梅山豬×杜洛克豬、梅山豬×漢普夏豬、梅山豬×長白豬、民豬×漢普夏豬和民豬×長白豬所組成的五個三代雜交資源家系，運用 PCR-RFLP 方法檢測 Bam HI、Msp I、Rsa I 3 種限制性內切酶的多態性，分析與豬初生重、21日齡重、斷奶重、平均日增重、背最長肌面積、肉色、大理石紋、硬度、背膘厚測量值等指標的相關性。結果發現，Msp I CC基因型的豬相對于DD基因型豬有較高的出生重（CC型比DD型高0.12kg），在幾個背膘厚測量指標上，也均高于DD基因型豬，而CC基因型最初來自于中國豬種所具有的等位基因[8]。通過以上分析，認為POU1F1與豬早期生長性狀存在相關性，是標記早期生長性狀的最接近的基因。

為了具體研究豬POU1F1基因的酶切多態性與中國地方家系品種生長性能的相關性，滕勇等采用PCR-RFLPs技術檢測Msp I酶切位點多態性，分析Msp I酶切突變位點不同基因型對“長杜楓姜”豬不同日齡段體重和日增重的影響。結果發現：MspI DD基因型豬在45、70、180日齡重上均與CD基因型和CC基因型豬呈顯著性差異；對于不同日齡段日增重，DD基因型豬也與CC基因型豬呈顯著性差異[9]?？梢奝OU1F1基因對豬的中期發育也起一定的作用。

結合以上研究，我們認為POU1F1基因對豬的早中期發育均起一定的作用，因此該基因可以作為數量性狀的遺傳標記。

1.4 POU1F1基因的研究前景 POU1F1基因的一個主要發展前景就是其在發育機制的早中期均起作用。據報道，雞胚發育到2d時即已檢測到POU1F1 mRNA的表達，牛POU1F1基因的轉錄激活貫穿于牛整個胚胎期的發育，而且豬和鼠POU1F1基因的表達均與它們的早期發育存在著相關性。這些就為檢測動物早期的表型性狀及飼養價值評估提供了依據，節省了遺傳育種大批量生產的麻煩，更好地為企業的產業化經營服務。

2GH基因

生長激素（GH）是一種由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的單一肽鏈蛋白質類激素。在動物生長軸中，GH是調控動物生長發育和合成代謝的核心激素，其作用機理復雜，影響動物機體蛋白質、脂肪和糖的代謝，與生長發育、繁殖等密切相關。

2.1 GH的生物學功能 生長激素的功能分為三類：代謝效應、增殖效應和分化效應[10]。它具有促進各組織器官發育，增加體細胞大小與數量，促進骨骼增長，促進有絲分裂，促進脂肪前體細胞成熟分化、骨髓T細胞前體發育以及造血細胞分化等作用。生長激素最普遍的作用是促進物質合成代謝。它可直接刺激葡萄糖進入肌肉細胞，加速蛋白質合成，增加肌肉重量和蛋白質沉積，使能量由脂肪組織向其他組織轉移。GH能提高氨基酸合成蛋白質的速度，降低氨基酸的氧化分解；在GH作用下，蛋白質周轉代謝的總量減少，合成量大于降解量，從而提高蛋白質的沉積量。

GH通過降低機體內葡萄糖轉化成脂肪酸的速度，抑制脂肪酸合成酶mRNA的轉錄和乙酰CoA羧化酶（CBX）、脂肪合成酶的活性，降低脂肪酸的合成酯化，同時刺激脂肪的酶解作用，從而減少脂肪的沉積，GH還可改變脂肪組織對胰島素的效應，拮抗胰島素對脂肪合成的刺激作用。GH對糖代謝的影響比較復雜，不直接參與糖代謝的調節，但它可改變組織對糖代謝的敏感性。生長激素對糖代謝的影響表現為胰島素樣和抗胰島素樣效應。生長激素處理初期，血糖降低，此時葡萄糖的攝取和氧化加強，生長激素表現出胰島素樣效應。但過一段時間后，葡萄糖氧化減少，血糖濃度顯著升高，同時胰島素濃度也升高，生長激素降低了靶組織對胰島素的敏感性，表現出抗胰島素效應[11]。

2.2 GH基因的結構與定位 近二十年來，國內外學者已經對豬GH基因結構做出了大量基礎性工作。1983年Seeburg等成功克隆豬GH基因的cDNA，但沒有完整的5′端非編碼區[12]。Vize等首先確定豬的GH基因序列[13]。賈鋒等對豬GH基因的全序列進行了測定，得出豬GH基因cDNA長度約為896bp[14]。目前已知，豬GH基因由5個外顯子和4個內含子構成， 外顯子大小分別為 10bp、161bp、171bp、162bp 和198bp，其中外顯子1最小，編碼前導肽中的3個氨基酸，外顯子5最大。該基因4個內含子的大小分別為242bp、210bp、197bp和278bp， 其位置、 大小與人、牛和鼠的生長激素基因類似；其核酸序列的組成、內含子的位置和長度、啟動子、5′和3′端非轉錄區都有很高的保守性。

2.3 豬GH基因的多態性研究 Kirkpatrick等首先擴增出豬生長激素基因+48～+889位長約842 bp的片段。在17頭無相關漢普夏和約克夏公豬中檢測到GH基因5′端和第2內含子存在RFLP，且5′端的等位基因頻率存在品種間差異[15]。Kirkpatrick等又對24頭無相關約克夏和19頭遠交個體的GH基因+206～+711位進行了PCR-RFLP檢測，發現Hae II在+308位呈多態性，Msp I在+577位呈多態性[16]。Larsen等用PCR-RFLP技術分析了丹麥4個豬種GH基因的-119～+486位片段，發現Apa I于+299位，Cfo I于+330和+379位呈多態性[17]。方美英等采用PCR-RFLP方法檢測6個豬種（姜曲海豬、內江豬、杜洛克豬、桃源豬、香豬、民豬）的GH基因第2外顯子區的遺傳變異[18]。他們所擴增的GH基因座位230bp片段，經用Hha I酶切，產生了遺傳多態性。在此片段上共存在2個Hha I酶切位點，依次產生124bp、49bp和57bp。兩個酶切位點是由507處的C/T替換以及555～556處的G/A和C/A替換形成的。劉紅林等對中國地方豬種生長激素基因Hha I酶切片段的多態性特征也進行了研究，他們采用PCR-RFLP技術分析了8個中國地方豬種（太湖豬、姜曲海豬、金華豬、皖浙花豬、內江豬、香豬、桃源豬、民豬）和4個國外豬品種（皮特蘭豬、長白豬、大約克豬、杜洛克豬），結果表明，在生長激素第2內含子和第2外顯子區Hha I酶切等位片段的頻率在豬種間存在顯著差異，其結果與方美英等人的研究結果一致[19]。

宋成義等（2001）利用PCR-RFLP技術分析了姜曲海豬GH基因+206～+711位共506 bp片段中的2處突變位點[20]，結果表明，Apa I酶切突變位點G4G4基因型個體的70日齡體重極顯著高于G3G3/G3G4基因型個體（P<0.01）；G4G4基因型個體的0～70日齡日增重也極顯著高于G3G3/G3G4基因型個體（P<0.01）。仲飛等以PCR方法擴增了GH基因的第1內含子，經測序表明，擴增的GH基因第1內含子的序列與Vize等在1987年發表的序列存在6個堿基的差異，有高度的同源性，同源性達97.5%，說明GH基因第1內含子具有多態性[21]。俞沛初等采用PCR-RFLP技術對香豬、上海白豬、大約克夏豬的生長激素基因-119～+715區域共843bp片段的擴增產物，分別用Apa I、Dra I、Msp I 3種限制性內切酶檢測酶切位點的多態性，結果顯示，3個品種都產生了Apa I的酶切多態性，經測序發現，該酶切位點是由位于第1內含子的+295位處的酶切位點缺失所造成的，導致切點缺失的原因是+295位上發生了G/A替換[22]。

圖1 部分GH基因中限制性多態位點

所有這些都說明豬的生長激素（GH）基因座位表現出了廣泛的多態性。綜合以上研究，可繪出部分GH基因中限制性多態位點圖（圖1）。

2.4 GH基因的研究前景 盡管國內外學者對GH研究較多，但大部分研究集中在對GH的生產和應用效果方面，如利用GH基因生產轉基因豬和利用基因工程菌株來高效表達GH基因，以及生長激素對豬生長性能、胴體性狀和組成、肉質、營養代謝等的影響。而真正研究GH基因多態性與生產性能關系的還不太多。已有的這些研究大多數集中在對多態位點的尋找上，其生物學意義還沒有確定，與生產性能的相關分析也比較膚淺，尚不能在豬的育種和生產實踐中應用。

在今后的研究中，應根據GH基因的多態性來判斷其基因型，并對這些不同基因型進行分析，找出各種基因型與數量性狀的相關性，從而將分子生物學技術應用到動物育種實踐中去。

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