枯草芽孢桿菌固體發酵條件優化

楊 婷，廖美德，賀玉廣，劉偲嘉

（華南農業大學天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣州 510642）

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

枯草芽孢桿菌固體發酵條件優化

楊 婷，廖美德*，賀玉廣，劉偲嘉

（華南農業大學天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣州 510642）

為研究初始pH、蛋白胨濃度和不同發酵底物對枯草芽孢桿菌生長的影響，對不同發酵底物進行液態和固態發酵試驗，結果發現，pH為6.5～7.0時，細菌生長最快，pH為7.5～8.0時，蛋白酶的活性最強；蛋白胨1.6 g·L-1的LB培養基，枯草芽孢桿菌的生長狀況最好，蛋白酶的活力也最強；豆粕是優質氮源，能顯著促進枯草芽孢桿菌的生長和蛋白酶活性，豆粕20%、豆渣10%、麩皮60%和玉米粉30%作為固態發酵底物，枯草芽孢桿菌的生長速度最快，豆粕10%、豆渣10%、麩皮50%和玉米粉10%為固態發酵底物，枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力最強。

枯草芽孢桿菌；發酵；正交實驗

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

枯草芽孢桿菌是一類廣泛分布于各種不同生活環境中的革蘭氏陽性好氧型細菌，常作為益生菌添加在幼小動物日糧中，能夠起到改善動物腸道菌群結構、提高消化酶活性、改善機體免疫功能以及提高生產性能的作用，對人畜無毒害作用，不污染環境[1-2]。枯草芽孢桿菌可產生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等，對提高動物的飼料轉化率、促進營養的消化吸收和預防疾病起到重要作用[3-5]。目前，在工業化生產中，仍然存在發酵周期長、芽孢形成率低、成本高等問題。本文在前人的研究基礎上，以玉米粉、麩皮、豆粕、豆渣為原料，旨在尋找出一種高效經濟的發酵底物，獲得較高的枯草芽孢桿菌產量和酸性蛋白酶活力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種為枯草芽孢桿菌，華南農業大學天然農藥與化學生物學教育部重點試驗室保存；豆粕、豆渣和玉米粉均購買于廣州市花鳥魚蟲市場。

培養基的制備。液體LB培養基：蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、酵母粉0.5 g、蒸餾水100 mL；固體LB培養基：液體培養基+2%的瓊脂粉，121℃，滅菌20 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 初始pH對細菌生長和蛋白酶活性的影響

設置初始pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的液體LB培養基，每組設6組重復，2%的接種量接入枯草芽孢桿菌菌種，180 rpm恒溫培養箱中培養24 h后，培養液稀釋10倍測OD600。菌液5 000 rpm離心10 min，除去菌體，取上清液待用。用移液槍吸取上清液0.5 mL，注入奶粉-瓊脂雙層平板的點樣孔之中，放置4和8 h后測量水解圈的大小，測定其蛋白酶活性。

1.2.2 蛋白胨對細菌生長和蛋白酶活性的影響

以液體LB培養基（蛋白胨濃度為10 g·L-1）為對照組，不同濃度蛋白胨的LB培養基為處理組，蛋白胨濃度設為12、14、16、18和20 g·L-1，每組設6個重復，試驗操作同1.2.1。

1.2.3 豆粕、豆渣和玉米粉對枯草芽孢桿菌生長的影響

配制豆粕（豆渣、玉米粉和麩皮）培養基（固體∶水=1∶20），混合均勻，121℃，滅菌20 min，備用。液體LB培養基，每組設6個重復，試驗操作同1.2.1，稱取1 g發酵物用平板稀釋法計算活菌數。

1.2.4 單因素正交實驗

枯草芽孢桿菌發酵底物正交實驗的因子與水平見表1。按照表1配制固體培養基，料水比為1∶1，加入1%氯化鈉，攪拌均勻，121℃，滅菌20 min，備用。接種量V/M（V-液體種子體積數，M-固體發酵培養基的質量）為2%。常溫發酵24 h后，稱取 發酵物1 g，用平板稀釋法計算活菌數。按照福林-酚試劑法測定蛋白酶活力。

表1 枯草芽孢桿菌發酵底物正交實驗的因子與水平 %

1.3 統計分析

試驗數據采用Dps 7.05軟件進行顯著性分析，并采用Duncan's新復極差法進行分析，結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 初始pH對細菌生長和蛋白酶活性的影響

初始pH對細菌生長和蛋白酶活性的影響見表2。

表2 pH對細菌生長和蛋白酶活力的影響

由表2可知，不同初始pH對細菌生長和蛋白酶活性有一定的影響，在pH約6.5時細菌的生長速度最快，但蛋白酶活性最強時的pH為7.45。

2.2 蛋白胨對細菌生長和蛋白酶活性的影響

蛋白胨濃度對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響見表3。

表3 蛋白胨濃度對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響

由表3可知，蛋白胨16 g·L-1處理組較對照組細菌生長速度和蛋白酶活力都最好，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同培養基對細菌生長和蛋白酶活性的影響

豆粕、豆渣、玉米粉對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響見表4。

表4 豆粕、豆渣、玉米粉對枯草芽孢桿菌生長和蛋白酶活性的影響

由表4可知，豆粕不僅是優質氮源，能顯著促進枯草芽孢桿菌的生長（P＜0.05），同時對其蛋白酶活性影響更大。

2.4 正交實驗

2.4.1 血球計數板測定枯草芽孢桿菌活菌數

活菌數正交分析表見表5。

表5 活菌數正交分析

從正交實驗結果可知，影響細菌生長的主要因素影響力排列為麩皮＞豆粕＞玉米粉＞豆渣，最適培養基為豆粕10%、豆渣20%、麩皮60%、玉米粉20%。

2.4.2 蛋白酶活力測定結果

蛋白酶活力正交分析見表6。

由表6可知，影響酶活力的主要因素影響力為豆粕＞豆渣＞麩皮≈玉米粉，最適培養基為豆粕10%、豆渣10%、麩皮50%、玉米粉10%的酶活力達到最佳。

表6 蛋白酶活力正交分析

3 討論

枯草芽孢桿菌作為益生菌微生態制劑因其綠色、安全受到了畜牧工作者的推崇。優良的微生態制劑必須有足夠的活菌數量，為了盡量提高產品芽孢的數量,需要對其產芽孢的培養基進行系統優化,以降低生產成本,提高芽孢得率[6-7]。

種子培養基是供菌體生長繁殖用的，營養成分應易被菌體吸收利用，要較豐富和完整，其中氮源和維生素的含量應略高些，但總濃度略低為宜，以便菌體的生長繁殖。發酵培養基是供菌體生長繁殖和合成大量代謝產物用的，采用的原材料質量應相對穩定，同時不影響產品的質量，因此必須按照不同培養階段的微生物生理學特性提供適宜的培養基配方[8-9]。枯草芽孢桿菌在種子培養過程中，試驗中初始pH為6.5～7.0，細菌的生長速度是最快的；pH為7.5～8.0時，蛋白酶的活性最強；試驗中蛋白胨16 g·L-1的培養基中枯草芽孢桿菌的生長最佳，并且蛋白酶的活力也最強。

碳源是組成培養基的主要成分之一，其主要作用是供給菌種生命活動所需要的能量和構成菌體細胞成分和代謝產物中的碳素來源，目前，世界上主要選用玉米粉作為枯草芽孢桿菌發酵的碳源[10]。氮源作為枯草芽孢桿菌發酵培養基的另一個主要因素，在芽孢的形成上也發揮著重要作用，枯草芽孢桿菌在生產中常用豆餅粉作氮源[11]。C/N直接影響菌體的生長和代謝，過高過低都影響細菌的生長和產物的合成[12]。本試驗選用豆粕、豆渣、麩皮和玉米粉為發酵底物，結果表明，固體培養基中的麩皮含量對枯草芽孢桿菌的生長速度影響最大，以豆粕20%、豆渣10%、麩皮60%、玉米粉30%的固體培養基中枯草芽孢桿菌的生長速度最快；固體培養基中豆粕含量對枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力影響最大，以豆粕10%、豆渣10%、麩皮50%、玉米粉10%的固體培養基中枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力最強。

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Optimization of Solid-state Fermentation ofBacillus Subtilis

YANG Ting,LIAO Meide*,HE Yuguang,LIU Sijia

To study the effects of the initial pH,peptone concentration and different fermentation substrate on the growth of bacillus subtilis.For different fermentation substrate,liquid and solid state fermentation experiment was carried out.The result showed that the pH at the range of 6.5 to 7.0 made the bacteria grow fast,and pH 7.5 to 8.0 was better to protease activity.The bran content of the solid medium was the main factor for the bacillus subtilis growth,while 20%soybean meal,10%okara,60%wheat bran and 30%corn flour were the best substrate for bacillus subtilis growth;soybean played an important role on the activity of protease,while 10%soybean meal,10%okara,50%wheat bran and 10%corn flour as a fermentation substrate,the activity of protease would be strongest.

bacillus subtilis;fermentation;orthogonal test

S816.6

A

1001-0084（2015）03-0005-04

2015-01-27

廣州市科技局項目（2008J1-C221）

楊婷（1990-），女，湖北孝感人，碩士研究生，研究方向為微生物代謝產物。

*通訊作者：副教授，碩士生導師，E-mail:meideliaotg@163.com。