PFOA和PFOS對青海弧菌Q67的毒性作用評估

劉紅艷，秦光軍，莫凌云，易忠勝，李子院，張　飛(桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林　541004)

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PFOA和PFOS對青海弧菌Q67的毒性作用評估

劉紅艷，秦光軍，莫凌云，易忠勝，李子院，張飛
(桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林541004)

摘要:以淡水發(fā)光菌——青海弧菌( Vibrio qinghaiensis sp. -Q67)為檢測生物，應用VeritasTM微板光度計分別測定了全氟辛酸( PFOA)和全氟辛烷磺酸( PFOS)對Q67的毒性效應。結(jié)果表明:全氟辛酸為典型的S型劑量－效應關系，利用Weibull非線性函數(shù)進行曲線模擬，模擬函數(shù)可以有效估計化合物的半抑制毒性效應值EC50。全氟辛烷磺酸對Q67的毒性為非單調(diào)的U型劑量－效應關系，運用最優(yōu)權(quán)重理論和三次曲線回歸方法，通過SPSS統(tǒng)計軟件對劑量－效應曲線進行擬合，得到其三次回歸曲線方程。結(jié)果表明:在濃度介于( 5. 031E－4)～( 7. 133E－3) mol/L，全氟辛烷磺酸對Q67毒性效應為自穩(wěn)態(tài)區(qū)域，表現(xiàn)為Q67的發(fā)光強度增強，即在低濃度作用條件下，PFOA對Q67的毒性表現(xiàn)為抑制作用，而PFOS則表現(xiàn)為刺激興奮作用。

關鍵詞:全氟辛酸;全氟辛烷磺酸;青海弧菌;劑量－效應;最優(yōu)權(quán)重

表面活性劑是一大類有機化合物，它們的性質(zhì)極具特色，應用極為廣泛靈活，有很大的理論意義和實用價值。全氟有機化合物( fluorinated organic compounds，F(xiàn)OCs)［1－3］自1950年由3M公司( Minnesota Mining and Manufacturing，明尼蘇達礦務及制造業(yè)公司)研制成功以來，以其優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、高表面活性及疏水疏油性能，被廣泛地應用于工業(yè)生產(chǎn)和生活消費領域，尤其是其代表性化合物全氟辛烷磺酸( perfluorooctane sulfonate，PFOS)和全氟辛酸( perfluorooctane acid，PFOA)以及它們的鹽類更是被大量地應用在化工、紡織、涂料、皮革、合成洗滌劑、炊具制造等諸多與人們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P的生產(chǎn)中［4－5］。PFOA和PFOS具有難降解性和生物蓄積性，對生物體的組織和器官造成嚴重影響。大量研究表明: PFOA和PFOS對動物和人類具有神經(jīng)、肝臟、遺傳、生殖及其他潛在毒性［6－10］，因此被環(huán)境科學界認為是持久性有機環(huán)境污染物的新成員，其環(huán)境毒性研究越來越受到人們的重視［11－14］。本文選擇PFOA和PFOS作為研究對象，研究其發(fā)光菌發(fā)光抑制效應，旨在為FOCs的環(huán)境健康與風險評價提供理論依據(jù)，并為其微生物降解提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1主要儀器和試劑

VeritasTM微板光度計，美國Turner Biosystems公司; LS－B50L型立式壓力蒸汽滅菌器，上海醫(yī)用核子儀器廠; LRH－150Z型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠; Pipetman?型移液器( P20，2～20 μL; P100，20～100 μL; PUM12×300，20～300 μL)，法國吉爾森公司; SW－CF－IF型超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司; BT25S型五位電子天平，德國賽多利斯公司; WZR－D961型微量振蕩器，蘇州市東吳醫(yī)用電子儀器廠; KG23E66TI型西門子冰箱，西門子公司; LRH－150Z型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠; WZR－D961型微量振蕩器，蘇州市東吳醫(yī)用電子儀器廠。

全氟辛酸、全氟辛烷磺酸均購自于Sigma公司。用五位電子天平準確稱取一定量的PFOA和PFOS化合物后，用石英亞沸蒸餾水溶于100 mL棕色容量瓶中，制成濃度分別為9. 74E－3和2. 73E－2 mol/L的儲備液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫娣艜r間不超過4個月。

青海弧菌的培養(yǎng)基組成:磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、六水氯化鎂、無水氯化鈣和碳酸氫鈉，均購自廣東汕頭市西隴化工廠;氯化鈉和甘油，購自廣東新宇化工廠;胰蛋白胨，購自北京陸橋有限責任公司;酵母浸出膏和瓊脂粉，購自中國醫(yī)藥上海化學試劑公司。

1. 2菌種培養(yǎng)

淡水發(fā)光菌——青海弧菌( Q67)，購自華東師范大學，其培養(yǎng)方法見文獻［15－16］。將裝有凍干粉的安瓿瓶先置于4℃冰箱內(nèi)約10～15 min，在超凈工作臺中切開安瓿瓶，取已滅菌的ρB= 0. 008 ( kg/L) NaCl溶液100 μL點在培養(yǎng)皿平板上，用接種環(huán)取一環(huán)菌種蘸取點的溶液在平板上劃線，倒置放于恒溫培養(yǎng)箱中于22℃培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落接種于培養(yǎng)基上，于22℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于斜面，將培養(yǎng)好的第3代菌種置4℃冰箱中備用。再將培養(yǎng)好的菌種接種到50 mL液體培養(yǎng)基中，22℃振蕩培養(yǎng)16～24 h (保證Q67處于對數(shù)生長期)，待用。

1. 3實驗方法

應用文獻［15］的方法，在96微孔板第1排每孔加入100 μL蒸餾水作空白對照。第2排12孔中分別加入不同體積的毒物溶液，不滿100 μL液量的孔補以蒸餾水至100 μL。第3排與第4排加液方式同第2排，為其平行實驗。最后用12道移液器從第1排到第4排向每孔加入100 μL菌液，將96微孔板放在微量型振蕩器上震蕩10 s后，于VeritasTM微板光度計上測定其分光度，設置運行次數(shù)為3次，每運行一次后的延遲時間為150 s。

用計算出的12個空白測量值的平均值( I0)和每個濃度的樣品3次測量的平均值( I)，計算出各化合物在不同濃度下對發(fā)光菌的抑制率E

由圖4可知：（1）國際經(jīng)貿(mào)學院、金融管理學院、國際商務外語學院、法學院等學院的借閱人數(shù)呈現(xiàn)逐年遞增趨勢，因此采訪工作的對接也需要更加重視；（2）金融管理學院、統(tǒng)計與信息學院的借閱人數(shù)遞增趨勢減緩或略有下降，可根據(jù)采訪資源的實際情況合理配置這種借閱需求減少的學院。

E = ( I0－I) /I0×100%，( 1)

1. 4不同形狀劑量－效應曲線的擬合方法

對實驗測得的劑量－效應曲線( dose－respone curves，DRC)散點圖進行數(shù)學擬合的傳統(tǒng)方法是線性回歸法，它只適用于DRC中線性部分的描述，其他部分特別是低劑量區(qū)域信息無法評價。劉樹深等［15，17－18］發(fā)現(xiàn)的Weibull( S)、Logit( S)和Biphasic ( J)函數(shù)分別用于描述非線性函數(shù)的S型和J型曲線。經(jīng)過篩選，本文的劑量－效應曲線主要用Weibull模型來描述，其函數(shù)為

E = 1－exp(－exp(α+β×log10( c) ) )，( 2)而對于低劑量刺激的U型曲線則無法用上述函數(shù)描述。為了解決濃度和抑制率之間的相關擬合程度的問題，根據(jù)統(tǒng)計學原理，現(xiàn)已發(fā)展出最優(yōu)權(quán)重理論［19］用于這一領域。

關于權(quán)重的應用問題，在目前學術上大多用于組合模型理論，本研究亦如此。組合模型就是設法把不同的模型、方法組合起來，綜合利用各種方法提供信息，在組合模型中賦予不同的模型或方法一定的權(quán)重。為此，組合模型最關鍵問題是如何確定不同模型的權(quán)重。從統(tǒng)計學角度講，解決這一問題的基本原則是必須使組合模型誤差最小，即賦予誤差較大的模型最小權(quán)重。因此，組合模型完全有可能改善系統(tǒng)預測的性能，提高模型預測的精度和可靠度。

通過觀察濃度與抑制率的變化數(shù)據(jù)，提取出多組數(shù)據(jù)進行曲線擬合實驗，運用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計曲線回歸分析，得出濃度和抑制率之間大體呈現(xiàn)三次曲線回歸關系，且R2較大(大于0. 98)。故選取三次曲線回歸模型以擬合濃度與抑制率之間的關系。

三次曲線回歸方程為其中: E是效應; c是濃度; bi( i = 1，2，3)是方程系數(shù)。

確立組合模型權(quán)重的基本原則是必須使組合模型誤差最小，即賦予誤差較大的模型最小的權(quán)重。對于模型權(quán)重的確定，目前的研究主要有合成法和區(qū)域合成法兩大類。權(quán)重合成法又包括平均值法、標準差法、二項式系數(shù)法、離異系數(shù)法、AHP法，使用較多的是標準差法。

權(quán)重計算公式

于是便可得到權(quán)重近似最優(yōu)模型的方程為

2　結(jié)果與討論

2. 1全氟辛酸的低劑量刺激對Q67的毒性分析

根據(jù)實驗結(jié)果，以非線性最小二乘法擬合DRC曲線。根據(jù)R2選擇最佳模型Weibull函數(shù)對測定的毒性數(shù)據(jù)點進行非線性擬合。表1列出了全氟辛酸的DRC模型及參數(shù)，擬合曲線與實驗測定的劑量－效應散點圖及其DRC模擬曲線見圖1。

從表1可知，這個化合物的DRC擬合值與實驗值之間的R2為0. 990 7，擬合統(tǒng)計性顯著。擬合參數(shù)α值為9. 533 7，β值為3. 367 7，全氟辛酸的β值較大，即劑量－曲線的陡度較大，說明其毒性隨濃度的增加變化較快。

表1　全氟辛酸的DRC優(yōu)化模型及參數(shù)Table 1　DRC model and parameters of Perfluorooctanoic acid

圖1　全氟辛酸的劑量－效應關系Fig. 61Dose response relationship for Perfluorooctanoic acid

從圖1中可以直觀地看出，Weibull函數(shù)可以很好地表達化合物的劑量－效應曲線。半致死濃度或半抑制率濃度是評價物質(zhì)生物毒性的重要指標，半抑制濃度愈大其毒性愈小。結(jié)果表明:全氟辛酸的EC50值為1. 149E－3 mol/L，其對Q67的低劑量毒性為抑制作用，其劑量－效應曲線為典型的S型。

2. 2全氟辛烷磺酸的低劑量刺激對Q67的毒性分析

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，全氟辛烷磺酸對Q67的劑量－效應曲線并不能通過Weibull ( S)、Logit ( S) 和Biphasic ( J)函數(shù)來擬合，通過對多組實驗數(shù)據(jù)進行最優(yōu)處理和分析，將數(shù)據(jù)導入SPSS軟件進行統(tǒng)計方差分析，求出濃度與抑制率的三次曲線回歸模型的方程系數(shù)及標準誤差Si。應用式( 4)進行權(quán)重理論分析，分別求出3組數(shù)據(jù)的權(quán)重Ki，然后根據(jù)式( 5)可求出組合三次曲線回歸方程

E = 0. 125 064－272. 194c + 47 859. 08c2－

1 705 249c3。( 6)通過計算得到抑制率的擬合值，將數(shù)據(jù)導入SPSS統(tǒng)計軟件進行三次曲線擬合，得到全氟辛烷磺酸對Q67的劑量－效應曲線(圖2)。

圖2　全氟辛烷磺酸的DRC關系Fig. 62Dose response relationship for Perfluorooctane sulfonate

由圖2可知，其劑量－效應曲線呈現(xiàn)“U”型曲線。一般認為，大多數(shù)類型的毒性反應具有閾劑量。所謂閾劑量［20］，是指在劑量－效應關系中存在著一個劑量，低于此劑量個體反應幾率為零。而在圖2中，當濃度大于或小于閾劑量時，全氟辛烷磺酸對Q67產(chǎn)生毒性作用加強，發(fā)光強度減弱，濃度介于( 5. 03E－4)～( 7. 13E－3) mol/L時，對Q67的毒性作用幾乎可以說為零或更低，即發(fā)光菌中的螢光素酶數(shù)量有所增加，從而使Q67的發(fā)光強度增強。當濃度大于7. 13E－3 mol/L時，對Q67的低劑量毒性表現(xiàn)為抑制作用，其EC50值為1. 009E－2 mol/L。

就本實驗而言，全氟辛烷磺酸對發(fā)光菌抑制率低于閾劑量［20］時，將不抑制發(fā)光菌的發(fā)光;高于閾劑量，將抑制其發(fā)光。閾劑量效應的以下范圍，被稱為自穩(wěn)態(tài)區(qū)域，即圖2中抑制率為零以下的區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)樣品對發(fā)光菌發(fā)光無抑制，而是促進生長，這與加入樣品后發(fā)光菌發(fā)光體系性質(zhì)變化有關:首先，發(fā)光菌的發(fā)光是一種生理過程，受體系氧化還原電位、H+與OH－濃度的影響;其次，樣品的加入，打破了原體系的發(fā)光平衡，加之樣品自身特性，這些外因?qū)w系的共同作用，在某種程度上激發(fā)了發(fā)光菌熒光酶活性(或激發(fā)發(fā)光菌發(fā)光活性)。這種激發(fā)不是在某個劑量點的行為，而是一定的劑量范圍。樣品在這個劑量范圍內(nèi)，對發(fā)光菌的發(fā)光代謝均起到促進作用。這種促進作用又有所不同，以最大促進生長點ECmin(即圖2中曲線部分的最低點)為分界，在該點的左側(cè)隨樣品劑量的增大，促進作用增強;在ECmin點的右側(cè)隨劑量的增大，促進作用減弱。

3　結(jié)論

以青海弧菌為指示生物，用VeritasTM微板光度法測定了全氟辛酸和全氟辛酸磺酸兩個化合物對Q67的抑制毒性，其中全氟辛酸化合物對Q67的劑量效應曲線可用Weibull函數(shù)表征，運用非線性最小二乘技術進行劑量－效應曲線擬合。擬合結(jié)果與實驗結(jié)果之間的R2為0. 990 7，擬合統(tǒng)計性顯著。同樣測定了全氟辛酸磺酸對Q67的抑制毒性，而全氟辛烷磺酸對Q67的劑量－效應曲線不能通過常用的Weibull( S)、Logit( S)和Biphasic ( J)函數(shù)來擬合，因此通過對多組實驗數(shù)據(jù)進行最優(yōu)處理，采用最優(yōu)權(quán)重理論，運用三次曲線回歸模型擬合其劑量－效應曲線，結(jié)果表明全氟辛烷磺酸的低濃度對青海弧菌Q67具有刺激興奮作用，即濃度介于( 5. 031E－4)～( 7. 133E－3) mol/L時Q67的發(fā)光強度增強，即在這兩者之間其對發(fā)光菌Q67的毒性作用為自穩(wěn)態(tài)區(qū)域。研究結(jié)果表明在低濃度作用條件下，PFOA對Q67的毒性表現(xiàn)為抑制作用，而PFOS則表現(xiàn)為刺激興奮作用。

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Evaluation of aquatic toxicity for PFOA and PFOS to Vibrio qinghaiensis sp. -Q67

LIU Hong-yan，QIN Guang-jun，MO Ling-yun，YI Zhong-sheng，LI Zi-yuan，ZHANG Fei
( College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China)

Abstract:In freshwater luminescent bacteria ( Vibrioqinghaiensis sp. -Q67) for biological detection，the inhibition toxicity of perfluorinated octylic acid ( PFOA) and perfluorinated octane sulfonic acid ( PFOS) to Q67 was tested by VeritasTMphotometer．In Weibull nonlinear function curve simulation，the dose-response relationship of PFOA in Q67 was typical S-type curve．The simulation function can effectively estimate semi-inhibition effect value ( EC50) of compounds．The inhibition curve of perfluorooctane sulfonate in Q67 was non-monotonic U-type curve．The dose-response curve was finished by the optimal weight curve theory and three regression curve equation with SPSS statistical software．The results show that the toxicity effect of PFOS on the Q67 has a lowdose stimulating effect when the concentration was between 5. 031E－4 mol/L and 7. 133E－3 mol/L．There is homeostasis region，and the luminescence intensity of Q67 is enhanced．The study shows that under the condition of low concentration effect，PFOA toxicity of Q67 characterizes inhibition，whereas PFOS performs stimulative effect．

Key words:perfluorooctanoic acid; perfluorooctane sulfonate; Vibrio qinghaiensis sp. -Q67; dose-effect; optimal weight

作者簡介:劉紅艷( 1970—)，女，碩士，副教授，研究方向:污染物毒理學，lhyglite@126. com。

基金項目:國家自然科學基金項目( 21207024; 21467006) ;廣西自然科學基金項目( 2011GXNSFA018059)

收稿日期:2014－03－19

doi:10. 3969/j．issn. 1674－9057. 2015. 01. 019

文章編號:1674－9057( 2015) 01－0121－05

文獻標志碼:A

中圖分類號:X131

引文格式:劉紅艷，秦光軍，莫凌云，等．PFOA和PFOS對青海弧菌Q67的毒性作用評估［J］．桂林理工大學學報，2015，35 ( 1) : 121－125．