殼聚糖鹽酸鹽對幾種水產致病菌的抑菌性研究

孫玉英，張繼泉*

（1.江蘇省海洋資源開發研究院，淮海工學院，江蘇 連云港 222005；2.中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室，山東 青島 266071）

目前，對蝦疾病仍然是困擾對蝦養殖業的一大難題，由弧菌屬（Vibrio）細菌引起的弧菌病是其中危害最大的細菌性疾病，給水產養殖業造成了嚴重的經濟損失[1-5]。由于弧菌是海洋環境中最常見的細菌類群之一，廣范分布于河口海區以及海洋生物體中，同時弧菌是一類條件致病菌，當水體環境變化，弧菌尤其是致病性弧菌繁殖迅速，如數量超過閾值則容易引發對蝦弧菌病。對蝦病的防治主要是通過添加化學物質、細菌組分、多糖、動植物提取物、營養因子以及細胞分裂素等免疫增強劑等增強對蝦的免疫力[6]。

殼聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖，殼聚糖作為抑菌劑具有毒性低、使用安全等優點[7-8]。目前殼聚糖作為抗菌劑得到了廣泛的應用，但殼聚糖較低的溶解性使其應用受到限制，對其進行化學改性后的水溶性衍生物可使其應用領域得到進一步的拓展[9]。其中殼聚糖鹽酸鹽是將殼聚糖簡單改性后的一種水溶性產物。由于殼聚糖鹽酸鹽保持了殼聚糖的品質，具有良好的成膜性和抑菌性，被用于食品、果蔬等的添加劑和保鮮劑。但殼聚糖鹽酸鹽被用于水產病害防治尚少見報道。本試驗研究殼聚糖鹽酸鹽對幾種水產致病弧菌的抑菌效應，從而探討殼聚糖鹽酸鹽用于防治對蝦弧菌病的可行性，旨在為對蝦弧菌病的防治提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）由淮海工學院海洋學院生物技術實驗室提供。

1.1.2 培養基

菌體的保存和培養均采用LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

固體LB培養基在液體培養基基礎上添加2%瓊脂。

1.1.3 藥品

殼聚糖鹽酸鹽：浙江金殼藥業有限公司，脫乙酰度為80.0%～90.0%，黏度為10～120 MPa·s。

1.2 儀器與設備

BS323S電子天平：賽多制斯科學儀器（北京）有限公司；spx-250B-Z生化培養箱：上海博迅實業醫療器械有限公司；HYG全溫振蕩培養箱：上海欣蕊自動化設備有限公司；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；HD920新型潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司：Infinite 200 PRO NanoQuant酶標儀：瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將菌種采用平板劃線法接種在平板上培養1 d，挑取單菌落進行擴大培養。液體培養基稀釋為107～108CFU/mL。

1.3.2 抑菌圈的測定[10]

用打孔器在濾紙上打出直徑6 mm的濾紙片，置于培養皿中高壓蒸汽滅菌（121 ℃滅菌20 min）后，備用。實驗組浸泡在殼聚糖鹽酸鹽溶液中，對照組浸泡在無菌水中。

按照無菌操作的要求向無菌培養皿中倒入適量LB培養基，每個培養皿中約10 mL，即培養基的厚度均約為3.6 mm。培養基凝固后，用移液器吸取0.1 mL菌懸液于培養基表面，用涂布棒涂布均勻，然后用鑷子取出100 mg/mL溶液中浸泡2 h的濾紙片，將濾紙片輕輕放入培養基表面，每個培養皿等距離放三個濾紙片，用無菌水做空白對照，置于培養皿正中央。放入培養箱恒溫培養（培養溫度30 ℃，培養時間24 h）。取出后觀察并用游標卡尺測出濾紙片抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果。

1.3.3 最小抑菌濃度測定

每種供試菌均設陽性對照（6個孔只加菌液），陰性對照（6個孔只加無菌培養基）。副溶血弧菌的殼聚糖鹽酸鹽溶液質量濃度為40 mg/mL，哈維氏弧菌和鰻弧菌的殼聚糖鹽酸鹽溶液質量濃度為60 mg/mL。在實驗組的每一個孔中各加入100 μL菌液，取相應質量濃度的供試藥液100 μL加入到實驗組的第一個孔中，混勻后，吸取100 μL混合液加入到第二個實驗孔，依次稀釋下去，直到第十二個孔混勻后吸取100 μL混合液棄去，每種供試菌的實驗組均設三組平行實驗共三行（每行12個孔）。用酶標儀在600 nm波長處測定其吸光度值，測定結束后將96孔板包好放在30 ℃恒溫培養箱中培養。每2 h測一次。以時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標繪制出對應的曲線。6～16 h后能抑制培養基內病原菌出現明顯生長的最小殼聚糖鹽酸鹽質量濃度作為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖鹽酸鹽的抑菌效力

采用濾紙片擴散法對殼聚糖鹽酸鹽的抑菌性能進行測定，結果見表1。

表1 殼聚糖鹽酸鹽對3種供試菌的抑菌圈Table 1 Antibacterial circle of chitosan hydrochloride on three tested strains

由表1可知，殼聚糖鹽酸鹽對所有供試菌都有抑制作用，但殼聚糖鹽酸鹽對供試菌的抑菌作用是有差異的。抑菌效力從大到小依次為副溶血弧菌＞哈維氏弧菌＞鰻弧菌。

2.2 不同質量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對供試菌的抑制作用

利用菌液作為陽性對照，滅菌培養基作為陰性對照，不同質量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對供試菌的抑制作用分別見圖1～圖3。

圖1 不同質量濃度的殼聚糖鹽酸鹽溶液對副溶血弧菌生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.parahaemolyticu

圖1 結果顯示，質量濃度 為20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL和2.5 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液在前10 h內對副溶血弧菌生長具有明顯的抑制作用，隨著溶液質量濃度增大抑制作用也明顯變大，在10～16 h內20 mg/mL和10 mg/mL質量濃度的仍然具有明顯的抑制作用，而5 mg/mL和2.5 mg/mL質量濃度的溶液則抑制作用變弱。連續培養16 h后，質量濃度1.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液對副溶血弧菌不再具有抑制作用，因此對副溶血弧菌的最小抑菌質量濃度為2.5 mg/mL。

圖2 不同質量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對哈維氏弧菌生長的影響Fig.2 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.harveyi

圖2結果顯示，質量濃度為30 mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液在前16 h內對哈維氏弧菌具有明顯的抑制作用，并且隨著質量濃度的增大抑制作用也逐漸增大。連續培養16 h后，殼聚糖鹽酸鹽的質量濃度為1.625 mg/mL時，對哈維氏弧菌的抑制不再明顯，因此對哈維氏弧菌的最小抑菌質量濃度為3.25 mg/mL。弧菌的抑菌圈直徑最大，因此可以認為殼聚糖鹽酸鹽對副溶血弧菌的抑菌效果最好。殼聚糖鹽酸鹽對副溶血弧菌的最小抑菌濃度為2.5 mg/mL，而對哈維氏弧菌和鰻弧菌的最小抑菌濃度3.25 mg/mL。上述研究為殼聚糖鹽酸鹽運用于對蝦弧菌病的防治提供理論依據。

殼聚糖在水質凈化、抗菌、提高機體免疫力等方面都具有良好的效果，且其原料豐富，降解產物無毒無害，解決了使用抗生素帶來的殘留和抗藥性問題。因此，其在無公害水產品的養殖生產中有著廣闊的應用前景[14-16]，但殼聚糖較低的溶解性使其應用受到限制。殼聚糖鹽酸鹽是殼聚糖簡單改性后的一種水溶性產物，不但保留了殼聚糖在水質凈化、抗菌和提高機體免疫力等方面的良好效果，而且殼聚糖鹽酸鹽對人體具有保健功能。所以探討殼聚糖鹽酸鹽用于對蝦弧菌病的防治具有重要的理論和現實意義。

圖3 不同質量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌生長的影響Fig.3 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.anguillarum

圖3結果顯示，在前6h，質量濃度為30mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌具有明顯的抑制作用，隨著時間延長，質量濃度降低，抑制作用慢慢減弱。連續培養6 h時，質量濃度為1.625 mg/mL殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌不再具有明顯的抑制作用，因此殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌的最小抑菌濃度為3.25 mg/mL。

3 結論

目前，防治對蝦弧菌病害的方法主要是藥物防治[11-13]，藥物防治雖然具有操作簡單，效果顯著等優點，但不可避免的會使機體產生一定的耐藥性，還會對水域環境造成不同程度的破壞，而且藥物殘留也會對后續的食品安全造成很大影響。

本實驗對殼聚糖鹽酸鹽的體外抑菌性能進行了研究，采用濾紙片擴散法測定了殼聚糖鹽酸鹽對副溶血弧菌、哈維氏弧菌和鰻弧菌的抑菌性能。殼聚糖鹽酸鹽對副溶血

[1]LIGHTNE R D V,REDMAN R M.Shrimp diseases and current diagnostic methods[J].Aquaculture,1998,164(1):201-220.

[2]SOTO-RODRIGUEZ S A,GOMEZ-GIL B,LOZANO R,et al.Virulence ofVibrio harveyiresponsible for the‘Bright-red’Syndrome in the Pacific white shrimpLitopenaeus vannamei[J].J Invertebr Pathol,2012,109(3):307-317.

[3]PHUOC L H,CORTEEL M,NAUWYNCK H J,et al.Increased susceptibility of white spot syndrome virus-infectedLitopenaeus vannameitoVibrio campbellii[J].Environmen Microbiol,2008,10(10):2718-2727.

[4]SELVIN J,LIPTON A P.Vibrio alginolyticusassociated with white spot disease ofPenaeus monodon[J].Dis Aquat Organ,2003,57(1/2):147-150.

[5]林禾杰，王祖薇，胡裕松，等.弧菌病——對蝦養殖重大災害的防治[J].當代水產，2013（3）：66-68.

[6]仲偉靜，王安利.對蝦免疫多糖的研究進展[J].水產科學，2009，28（8）：482-484.

[7]楊宇民，馬振祥，尹繼成，等.系列水溶性殼聚糖衍生物的抑菌性能研究[J].中國公共衛生，2005，21（9）：61-62.

[8]王鳳菊，陳 煜，譚惠民.殼聚糖季銨鹽抗菌劑的研究進展[J].化工新型材料，2011，39（11）：13-15.

[9]鄒耀邦，王 璐，孝 波.生物質材料：甲殼素/殼聚糖的溶解性與應用研究進展[J].材料導報，2003，17（5）：51-54.

[10]劉 偉，王 冰，周麗威，等.四種植物提取液抑菌作用的分析[J].通化師范學院學報，2012，33（6）：25-26.

[11]曾 鵬.對蝦育苗弧菌病的防治[J].河南水產，2011（1）：28.

[12]宮春光，于清海，陳福杰.南美白對蝦育苗中弧菌病和絲狀細菌病的防治對策[J].科學養魚，2008（9）：50-51.

[13]王傳芬.從菌絲體中提取殼聚糖的研究[J].中國釀造，2009，28（10）：123-126.

[14]馮小強，李小芳，楊 聲.殼聚糖抑菌性能影響因素、機理及其應用研究進展[J].中國釀造，2009，28（1）：24-28.

[15]馮小強，楊 聲，王廷璞，等.不同分子量殼聚糖對大腸桿菌抑制作用規律及其機理探討[J].中國釀造，2009，28（1）：20-23.

[16]劉 勇，龔建海，魏 能.殼聚糖在水產養殖中的研究進展[J].飼料工業，2011，32（20）：62-64.