北蟲草素對體外小鼠肝癌H22細胞增殖及肝癌鼠血清中IL-2/TNF-α水平的影響

北蟲草素對體外小鼠肝癌H22細胞增殖及肝癌鼠血清中IL-2/TNF-α水平的影響

張莉莉1，陳偉2，梁國強2*

(1.蘇州市立醫院(本部)門診藥房,江蘇 蘇州 215000；2.蘇州市中醫醫院 吳門醫派研究院，江蘇 蘇州 215000)

摘要：目的探討北蟲草素對體外培養的小鼠肝癌H22細胞的增殖和H22荷瘤肝癌小鼠血清中IL-2和TNF-α水平的影響。方法 分別用5，10，20，40，80 mg/L的北蟲草素處理H22細胞48 h后，應用MTT法檢測細胞的增殖抑制率；采用細胞接種的方法建立H22肝癌小鼠動物模型，隨機分成5組，每組8只,雙抗體夾心法(ELISA)檢測小鼠血清IL-2和TNF-α數值。結果北蟲草素呈劑量依賴性抑制H22細胞增殖(F=105.333，P<0.001)；環磷酰胺組、北蟲草素中高劑量組小鼠瘤重顯著低于對照組(P<0.01)，抑瘤率分別為55.60%，32.94%，43.94%。與對照組比較，北蟲草素中高劑量組IL-2及TNF-α在血清中的表達均顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05或0.01)。結論北蟲草素能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，增強機體的免疫功能。

關鍵詞：北蟲草素；抗腫瘤；免疫功能；IL-2；TNF-α；小鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.027

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)02-0184-03

基金項目:2012年蘇州市“科教興衛”青年科技項目(SS1326)。

作者簡介:張莉莉(1976-)，女，大學本科，主管中藥師，主要從事中藥學及中藥成分分析。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-07-03)

*通信作者:梁國強，電話-13584809803，電子信箱-616250366@qq.com

Effects of North Cordyceps on proliferation of hepatoma-22 cells in vitro and IL-2/TNF-α

in serum on Hepatic Cancer Mice

ZHANG Lili1,CHEN Wei2,LIANG Guoqiang2

(1.Outpatient pharmacy,Suzhou Municipal Hospital,Suzhou 215000,Jiangsu Province,China;

2.Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Institute of Wumen Traditional Chinese Medicine,

Suzhou 215000,Jiangsu Province,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of North Cordyceps on proliferation of hepatoma-22 cells in vitro and IL-2/TNF-α in serum on Hepatic Cancer Mice.MethodsMTT was employed to detect proliferation ability of H22 cells treated with 5，10，20，40，80mg/L North Cordyceps for 48 h,respectively,the model of hepatoma-22 Hepatic Cancer Mice were established by the cell inoculation Method,and the animals were randomly divided into 5 groups.8 rats in each group were pick up randomly.The number of IL-2 and TNF-α were detected by Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).ResultsThe proliferation inhibtion rate of North Cordyceps on H22 cells were enhanced in a dose-dependant manner (F=105.333,P<0.001).The inhibiting rate of Cyclophosphamide group,cordycepin in the Middle,high dose group was 55.60%,32.94% and 43.94% by using analysis of variance method,which was obviously lower than control group (P<0.01).Compare with control group the expression of IL-2 and TNF-α in serum was increased in cordycepin in the middle,high dose group.The difference between two groups had statistical significance (P<0.05 or 0.01).ConclusionNorth Cordyceps could obviously inhibit the growth of tumor and enhance the immune functions in bearing mice.

Keywords:North Cordyceps;antitumor;immunological function;IL-2;TNF-α;mice

蟲草素(cordycepin)是迄今為止發現的唯一的天然核苷類抗生素，也是自然界相對富集的天然抗癌抗生素，蟲草素即3-脫氮腺苷，為含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿，有抗病毒，抗腫瘤作用，尤其對多種實體惡性腫瘤有很強的抑制作用[1]。北蟲草(蛹蟲草)與冬蟲夏草為蟲草屬的同屬異種真菌，兩者的化學成分、營養成分和藥用功能均非常相似，其主要藥用成分蟲草素等含量遠高于野生冬蟲夏草，而且比冬蟲夏草更易于人工栽培[2-3]。對北蟲草(蛹蟲草)化學成分的提取、分離、鑒定及藥理作用雖已有較多研究，但對于其化學成分北蟲草素與藥理活性關系還有待進一步深入研究[4-5]。原發性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是常見的消化系統惡性腫瘤之一，筆者以體外小鼠肝癌H22細胞和肝癌H22細胞荷瘤小鼠為實驗模型[6-7]，觀察從人工蛹蟲草中提取的北蟲草素對小鼠肝癌H22細胞生長的抑制作用以及對肝癌H22細胞荷瘤小鼠在體抑制瘤體作用，同時觀察其對瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平的影響。

1實驗材料

北蟲草素由南京中醫藥大學植物藥深加工中心應用人工蛹蟲草提取，人工蛹蟲草由南通市海安縣泓壽生物科技有限公司提供。小鼠肝癌H22細胞株,由南京中醫藥大學藥學院藥理實驗室惠贈。BALB/c小鼠，體質量18～22 g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，雌雄各半。RPMIDMEM培養基：美國Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青生物有限公司;胰蛋白酶閃晶生物有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)AMRESCO;環磷酰胺(CTX)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；IL-2和TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2實驗方法

2.1北蟲草素體外對H22細胞生長的影響將處于對數生長期的H22細胞調整密度為1×105個/mL，接種于96孔細胞培養板，24 h后,分別加入不同質量濃度的北蟲草素，使其終質量濃度分別為5，10，20，40，80 mg/L，同時設對照組。每組設6個復孔，置37 ℃、體積分數5%CO2飽和濕度的培養箱中培養48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，于570 nm波長處測各孔的吸光度(A)值，計算細胞的抑制率[8]=[(1-A)(給藥孔)/A(對照孔)]×100%。

2.2小鼠移植性腫瘤模型的建立及給藥收集肝癌H22細胞株，低速離心(10 000 r/min，5 min)3次，調整細胞密度為1×106個/mL，臺盼藍檢測細胞的存活率。將細胞(存活率≥95%)懸液0.2 mL注射至BALB/c小鼠右腋皮下，全程嚴格無菌操作[9]。24 h后采用隨機數字表法分5組(n=8)，即荷瘤對照組，環磷酰胺對照組及北蟲草素15、30、60 mg/kg 3個劑量組。同時設1組為不接種瘤株的生理鹽水正常對照組，正常與荷瘤空白對照組給予腹腔注射同體積的生理鹽水，環磷酰胺對照組給予20 mg/kg，各組均以10 mL/kg的體積連續腹腔給藥14 d，第15天麻醉，眼眶取血分離血清備用，小鼠斷髓處死,剝離瘤體,稱重。

2.3檢測指標動物體重增長率(%)=(給藥組增重-對照組增重)/對照組增重×100%；抑瘤率(%)=(荷瘤對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/荷瘤對照組平均瘤重×100%)；血清IL-2和TNF-α檢測，各組小鼠取血1 mL，不加抗凝劑，置于一次性離心管內，以3 000 r/min，5 min，取血清置于-20 ℃保存。采用ELISA法測定，操作步驟按照試劑盒說明進行。

3結果

3.1北蟲草素對H22細胞增殖抑制作用的影響見表1。

表1　北蟲草素對H 22細胞增殖作用的影響 ± s)

3.2北蟲草素對荷瘤小鼠體質量增長率的影響給藥前后除環磷酰胺組荷瘤鼠的體質量增加的幅度較對照組明顯小(P<0.001)，其他各組體質量均正常增加,而北蟲草素高劑量組增重明顯高于對照組(P<0.05)。說明環磷酰胺能夠損傷、加重荷瘤鼠的惡病質體質，導致其體質量增加出現異常，而北蟲草素高劑量改善荷瘤鼠的惡病質體質,提高生存質量。見表2。

3.3北蟲草素對抑瘤率的影響由表3結果表明蟲草素抑瘤效果未能達到臨床一線抗癌藥物環磷酰胺的效果；其抑制腫瘤生長的效果與其劑量成依賴性梯度關系。

表2　各劑量組對荷瘤小鼠動物體質量增長率的影響 ± s)

注：與空白對照組比較，# P<0.05，### P<0.001

注：與空白對照組比較，##P<0.01，###P<0.001

3.4北蟲草素各劑量組對H22荷瘤鼠血清IL-2和TNF-α水平的影響由表4結果可見，與荷瘤對照組相比,各給藥組能顯著提高荷瘤小鼠血清IL-2水平。與荷瘤對照組相比，各北蟲草組均提高荷瘤小鼠血清TNF-α水平；與空白、正常對照組相比,環磷酰胺組小鼠血清TNF-α水平顯著降低(P<0.001,表中未標記出)。提示環磷酰胺可能存在損傷荷瘤小鼠免疫因子TNF-α，而北蟲草素可能對免疫指標的損傷存在保護、改善的作用,這種作用也存在劑量依賴的關系。

組 別n劑量/(mg/kg)IL-2/(pg/mL)TNF-α/(pg/mL)空白組 8-154.7±28.4##62.4±4.2## 對照組 7097.2±25.1 47.3±5.3 環磷酰胺組620110.4±19.5# 18.9±1.6###北蟲草素低715115.7±27.5# 50.4±3.8 北蟲草素中830128.5±30.5# 68.4±5.7# 北蟲草素高860145.7±32.1##73.5±4.3##

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

4討論

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.)Link]為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬的模式種。經成分測定分析及藥理實驗證明可作為冬蟲夏草的替代品之一。蛹蟲草中主要活性成分蟲草素是蟲草中特有的活性成分，具有明顯的鎮靜、抗疲勞、抗腫瘤、抑制癌細胞和促使雄性激素分泌等作用，可增強機體免疫功能。根據蛹蟲草化學成分及藥理作用研究進展[10-11]，從其中提取的北蟲草素作為一種用途廣泛的新藥來開發是必然的趨勢[12-13]。

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