促紅細胞生成素原核表達載體構建分離純化

促紅細胞生成素原核表達載體構建分離純化*

馬麗婷1高秀峰1王胤吉1潘佳欣1趙佳皓1陽文龍2李永生3

(1．四川大學華西基礎醫學與法醫學院；2.四川大學臨床醫學院； 3.四川大學化學工程學院， 四川 成都 610041)

【摘要】目的構建和表達人源性促紅細胞生成素(EPO)，為促紅細胞生成素發揮功能與結構差異研究做準備。方法通過NCBI查找人源性促紅細胞生成素全基因序列并合成，構建原核表達載體pTWIN1-rhEPO，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，獲得高效表達重組轉化子菌株。結果成功構建人源性促紅細胞生成素原核表達載體，經酶切和DNA序列測序分析，結果表明該基因序列與合成序列完全相同。終濃度0.5mmol/L ITPG誘導表達，SDS-PAGE電泳分析，4小時時蛋白表達量最高。結論構建和表達重組載體pTWIN1-rhEPO，分離純化出目的蛋白，為進一步研究促紅細胞生成素組織修復功能及突變體相關功能研究奠定基礎。

【關鍵詞】促紅細胞生成素； 表達載體構建； 原核表達； 分離純化

【中圖分類號】R 331.1+4【文獻標志碼】A

基金項目：國家基礎科學人才培養基金(J1103604)

通訊作者：高秀峰 教授 博士生導師 郵箱：Xiufengg@163.com

收稿日期：( 2015-01-07； 編輯： 張文秀)

Vector construction, expression and purification of erythropoietinMA Liting1, GAO Xiufeng1, WANG Yinji1,etal

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,WestChinaSchoolofPreclinicalandForensic

Medicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;

2.WestChinaSchoolofMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;

3.SchoolofChemicalEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract【】ObjectiveTo construct and express the human-derived erythropoietin in order to study the differences in structure and function for the further research. MethodsThe rhEPO sequence was identified through NCBI and was synthesized, constructed Prokaryotic expression vector pTWIN1-rhEPO, transformed into E. coli BL21 (DE3), to obtain efficient expression of recombinant transformant strains respectively. ResultsSuccessfully constructed human-derived erythropoietin prokaryotic expression vector, as a result of digestion and DNA sequencing analysis showed that the gene sequence was identical with the synthetic sequence. The final concentration of 0.5mmol/L IPTG was used to induce protein expression, SDS-PAGE electrophoresis analysis, protein expression was highest at 4h. ConclusionConstructed and expressed the Prokaryotic expression vector pTWIN1-rhEPO, utilized chitin affinity chromatography to separate and purify of rhEPO, for further study of erythropoietin tissue repair functions and the mutants’ related functions do research foundation.

【Key words】Erythropoietin; Expression vector construction; Prokaryotic expression; Separation and purification

促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)是細胞因子家族的成員之一，是糖蛋白類激素。主要功能是刺激骨髓的紅系祖細胞分裂、分化為成熟的紅細胞[1]。EPO受體(Erythropoietin Receptor, EPOR)不僅分布在骨髓造血系統,還廣泛分布在非造血組織[2]。近年發現其還具有抗神經細胞凋亡、血管的再生和創面再生等效應[3]，特別是在腦損傷的神經保護中起重要作用，已成為研究熱點之一。但是，將EPO用于臨床組織損傷治療，會帶來血液粘稠、血栓形成、高血壓等副作用。因此，近年也有氨甲酰化EPO、EPO定點突變、EPO模擬肽等無促紅細胞生成作用的EPO衍生物的相關報道[4]。本研究擬利用定點突變技術改造rhEPO構建其突變體，希望表達的重組蛋白能夠對促紅細胞生成素受體的親和力下降，對神經組織表面的異源βcR的親和力增強，達到對神經組織修復和保護作用的同時減少因紅細胞生成過多導致的血液粘稠、血栓形成等副作用，為心、腦血管、組織損傷的治療，以及藥物的開發提供實驗依據。此階段的研究是構建EPO原核表達載體，篩選工程菌；并對表達EPO進行分離純化，為進一步的突變和功能研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1rhEPO基因、菌株及載體rhEPO全基因由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成，目的片段連接在pBLUE克隆載體上；DH5α購于全式金科技(北京)有限公司，E.coli BL21(DE3)由本實驗室保存；原核表達載體p-TWIN1購于成都金線科技有限生物公司。

1.1.2試劑質粒小量抽取試劑盒和瓊脂糖回收試劑盒由Axygen生物技術公司生產；酵母提取物和胰蛋白胨由OXOID公司生產；IPTG由生工生物工程有限公司進口分裝；trans 2K plus II DNA Marker、PrimeStars DNA聚合酶由寶生物工程有限公司生產；T4 DNA連接酶、NcoI、BamHI限制性內切酶由Thermo Fisher科技公司生產；幾丁質親和層析柱購于NEB公司；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1質粒DNA小量提取根據《質粒小量抽取試劑盒說明書》進行操作。

1.2.2rhEPO基因與原核表達載體pTWIN1連接與轉化將提取的質粒在37℃水浴下，NcoI和BamHI雙酶切過夜。經1%瓊脂糖電泳，膠回收目的片段rhEPO和pTWIN1大片段，經22℃水浴下，T4連接酶，連接1小時，轉化至感受態DH5α，涂平板，37℃過夜培養，挑取陽性單菌落活化，提取重組質粒，進行雙酶切及測序鑒定。

1.2.3重組質粒轉入表達菌誘導表達從克隆菌中提取出重組質粒，轉入感受態BL21(DE3)，將工程菌菌落于液體LB中，37℃過夜培養后，接種到新LB培養基中生長3h，0.5mmol/LIPTG誘導下表達4h。離心收集沉淀，重懸于高純水，超聲破粹，離心收集上清獲得粗蛋白液，SDS-PAGE電泳分析表達產物。

1.2.4重組蛋白rh-epo分離純化。將工程菌接種于250mlLB培養基中，37℃培養至OD值約為0.5，加入0.5mmol/L IPTG，37℃誘導表達4h，4℃離心收集菌體，加入10ml細胞裂解液B1(20mM Tris-Hcl,1mM EDTA,50mM Nacl,PH為8.5)重懸菌體，冰浴超聲破菌。破菌后菌液以12000g離心30分鐘，取上清，流速為0.5~1ml/min上樣于經過B1平衡后的幾丁質柱，收集穿出液；再用20倍柱體積B1裂解液平衡洗去未結合雜蛋白，快速加入誘導自剪切緩沖液B2(20mM Tris-Hcl,1mM EDTA,50mM Nacl,pH為5.5)，在室溫條件下誘導自剪切過夜。過夜后用B1緩沖液洗脫目的蛋白，經SDS-PAGE鑒定。

2結果

2.1p-BLUE-rhEPO和pTWIN大片段基因純化p-BLUE-rhEPO和pTWIN大片段基因純化瓊脂糖凝膠電泳圖譜，見圖1。

圖1p-BLUE-rhEPO和pTWIN大片段基因純化

Fig.1Purification of E.coil DH5α-pBLUE-rhEPO and E.coil DH5α-pTWIN1 gene segments

注：M:DNA Ladder; 1.pTWIN1基因片段；2.rh-EPO和pBULE-rhEPO基因片段

2.2重組pTWIN1-rhEPO的構建將上述純化并獲得的基因大片段利用T4連接酶連接轉化到感受態DH5α，提取重組質粒，雙酶切和測序鑒定。見圖2雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖譜。

圖2E.coil DH5α-pTWIN1-rhEPO 重組子 酶切鑒定

Fig.2Verification of positive clone with E.coli DH5α-pTWIN1-rhEPO by RE digestion

注：M:DNA Ladder; 1、2:E.col; DH5α-PTWIN1-rhEPO陽性克隆雙酶切，3:E.coli DH5α-pTWINI陽性克隆雙酶切

2.3含有pTWIN1-rhEPO質粒表達菌的構建將經鑒定成功的重組質粒pTWIN1-rhEPO 轉化到E.coil BL21(DE3)感受態細胞，提取重組質粒DNA，雙酶切鑒定，結果如圖3所示，該菌為表達菌重組子。

2.4rhEPO重組蛋白表達在37℃，120rpm轉速的搖床下，用250ml三角瓶裝有50ml LB液體培養基接種500μl過夜擴0.5mmol/L IPTG誘導培養5h，使細

圖3pTwin1-rhEPO重組子雙酶切鑒定

Fig.3Verification of pTwin1-rhEPO by RE digestion.

注：M:DNA Ladder; 1、2：pTWINI-rhEPO雙酶切

菌產生重組蛋白。實驗結果如圖4所示，生長時間為4h時，蛋白表達量最大。培養菌液，設定生長培養時間為1h、2h、3h、4h、5h，然后加入終濃度為加入終濃度為0.5mmol/L IPTG,37℃,120rpm轉速下誘導5h，使細菌產生重組蛋白。實驗結果如圖4所示,可知其最適表達蛋白條件為當細胞生長OD600=0.5~0.7時，加入終濃度為0.5mmol/L IPTG,37℃,120rpm轉速, 最適生長時間為4h時，蛋白表達量最大。

圖4E.coliBL21(DE3)-pTWIN1-rhEPO表達產物的SDS-PAGE分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of the recombinant protein produced by E.coli BL21(DE3)-pTWIN1-rhEPO

注：M:蛋白標記；0:E.col BL21(OE3)蛋白表達；1-5：1、2、3、4、5小時蛋白表達

2.5重組蛋白rhEPO初步分離純化原核表達載體pTWIN1-rhEPO表達的融合蛋白含有的幾丁質結合域 (chitin-binding domain，CBD)和內含肽1(intein1)。CBD可與幾丁質親和層析柱特異性結合，intein1在pH為5.5，室溫條件下，對rhEPO的N末端發生自剪切，目的蛋白rhEPO與CBD-intein1蛋白脫離，rhEPO游離于平衡液中，得到純化的rhEPO分子量約為18KD(見圖5)，與理論推導的分子量18Kd相符。

圖5純化的rhEPO的SDS-PAGE分析

Fig.5SDS-PAGE of rhEPO. M: protein marker;

注：rhEPO純化色譜；2:E.coliBL21蛋白表達；3:IPTG蛋白表達

3討論

促紅細胞生成素是一種含唾液酸的糖蛋白，由一條多肽鏈，166個氨基酸殘基組成，含有兩個二硫鍵，形成4個穩定的α-螺旋結構，分子量為18 kD，約30%~40%是糖基，其主要是甘露糖、巖藻糖和唾液酸等，它們在維持EPO分子活性、防止EPO失活等方面具有重要作用。人EPOR是由484個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，它是細胞超家族和生長因子受體中的一員，其結構分為三部分：跨膜區、胞外區和胞內區，高度保守的近膜區WSXSW結構是胞內信號分子結合位點的必須組成部分，起到與EPO特異結合并激活一系列信號通路的作用[4]。EPO誘導的紅祖系細胞和前體細胞的胞內信號通路的調節是通過同源二聚體EPOR實現[5,6]。EPO與EPOR結合后，EPOR形成二聚體，偶聯酪氨酸激酶(Janus tyrosine kinase-2, JAK2)，激活JAK2、信號轉導子、轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription-5,STAT5)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和核因子κB，啟動下游一系列因子,包括釋放各種細胞因子，調節紅細胞增埴、分化等[7]。腎臟及其他器官中存在β-common receptor(βcR, CD131)，系GM-CSF、IL-3 和IL-5 的受體共同亞單位，能與EPOR形成異源二聚體，發揮抑制細胞凋亡和組織保護作用，但不啟動造血信號的轉導[8]。EPO有4個α螺旋(A-D)，根據EPO與EPOR結合后的晶體結構，在C螺旋上，有6個位點Lys97、Ser100、Arg103、Ser104、Thr107、Leu108是與EPOR主要結合的位點[9,10]，EPO氨基序列(1-17)、內部(99-109)羧基末端(147-151)，及上述提及的幾個位點在發揮促紅作用時至關重要；國內外目前的主要研究是將以上重要位點進行氨甲酰化修飾、去唾液酸化[11,12]及定點突變，發現氨甲酰化的EPO無促紅作用而具有組織保護修復作用，其具體作用機制尚不清楚。

4結論

本研究通過構建原核表達載體pTWIN1-EPO，轉化表達菌BL21(DE3)利用0.5mmol/L IPTG誘導EPO表達，并成功利用幾丁質親和層析分離純化出該蛋白，在此基礎上將要構建促紅細胞生成素突變載體并表達，為進一步研究EPO組織修復功能及突變體相關功能奠定了基礎。

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