干旱對冬小麥葉片氣孔、活性氧和光合作用的影響

干旱對冬小麥葉片氣孔、活性氧和光合作用的影響

李思，張莉，姚雅琴

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌712100)

摘要：通過盆栽控水方式，以冬小麥小偃22葉片為實驗對象，利用生理指標測定、 光合測定和H2DCFDA熒光標記等相結合的方法，研究了4個水分處理下(正常供水CK；輕度虧水LS；中度虧水MS；重度虧水SS)，冬小麥葉片中活性氧含量、丙二醛(MDA)含量、活性氧清除系統的相關保護酶活性及水分脅迫情況下過氧化氫(H2O2)在小麥葉片內的分布情況，同時，還探討了不同水分脅迫處理對小麥氣孔的密度及光合性能指標的影響.結果表明，隨著水分脅迫程度的加劇，小麥葉片內H2O2和MDA含量逐漸增加；葉片的氣孔密度增加,其中重度脅迫較正常灌溉情況氣孔密度增加了44.12%；而光合性能指標(蒸騰速率、光合速率、氣孔導度和葉肉細胞間CO2濃度)隨水分脅迫的加劇呈下降的趨勢. H2O2在葉表皮中的含量隨水分脅迫加劇呈增加趨勢,且在重度脅迫情況下分布較其他情況更廣.本實驗為小麥抗旱機理的研究提供了實驗依據，為解決旱區農業作物種植問題提供了一定的理論指導.

關鍵詞：小麥；水分脅迫；活性氧；氣孔；光合特性

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.05.008

中圖分類號：Q945.78；S512.1文獻標志碼：A

收稿日期:2015-04-17

基金項目：國家自然科學基金資助項目(509073)

Effects of different water stress on active oxygen，stoma and

photosynthesis characteristics of wheat

LI Si，ZHANG Li，YAO Yaqin

(College of Life Science, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Abstract：By means of water control in pot culture, winter wheat (Triticum aestivum L. ) Xiaoyan 22 leaves are used as the experimental material to be tested by methods of physiological indicator detection， photosynthesis measurement and H2DCFDA flourescent dye to figure out the active oxygen amount, malonaldehyde content and distribution of hydrogen peroxide in winter wheat leaves under four water stress conditoins(Control as CK；Light drought stess as LS；Mediate drought stess as MS；Severe drought stess as SS). Meanwhile, the density of winter wheat stoma as well as hydrogen peroxide indexes under water stress has also been explored in this experiment. The results are as follows: with the water stress becoming severer, hydrogen peroxide and malonaldehyde content as well as the density of winter wheat stoma gradually increase, the density of stoma under severe drought conditions shows a rise of 44.12% than that

第一作者：李思(1989-)，女，河北正定人，西北農林科技大學在讀碩士研究生，主要從事植物抗旱生理研究.

E-mail：445613242@qq.com

通信作者：姚雅琴(1957-)，女，陜西澄城人，西北農林科技大學教授，主要從事植物逆境生理生態研究.

E-mail：yaoyaqin@nwsuaf.edu.cn

in the control group, while the photosynthetic characteristics (transpiration rate, photosynthetic rate, stomata conductance and CO2concentration within the mesophyll cells ) all indicate a trend of decrease. This study provides an experimental basis for the mechanism of wheat drought resistance, it also provides theoretical guidance for solving the problems in planting crops in arid area.

Key words：winter wheat; water stress; active oxygen; stoma; photosynthetic characteristics

水資源短缺已逐漸成為制約世界作物產量的關鍵因素[1].因此，對干旱和半干旱地區作物抗旱機理探索，是解決糧食問題的熱點研究課題.

隨著干旱脅迫的加劇，氣孔開度降低，氣孔中H2O2的含量急劇上升，表明H2O2在植物控制氣孔開度中的作用.由于H2O2有一定的不穩定性且來源和清除途徑廣泛，少有對在氣孔開關過程中H2O2的空間位移和濃度變化的研究.本實驗在對小麥干旱脅迫處理逐漸加劇的情況下，進行了對H2O2的熒光染色觀察，為H2O2參與氣孔運動的理論提供了實驗依據.通過盆栽控水方式，以冬小麥小偃22葉片為試材，利用生理指標測定和熒光標記等相結合的方法，研究了4個水分處理下冬小麥葉片中各生理指標隨水分脅迫的變化，為小麥抗旱機理的研究提供了實驗依據，為解決旱區農業作物種植提供了一定的理論指導.

1材料與方法

1．1　盆栽小麥及控水控肥處理

實驗地點選在西北農林科技大學中國旱區研究院內的大棚及溫室內，實驗區地理氣候狀況為海拔435～563 m，年降水量635.1～663.9 mm，年均氣溫12.9 ℃，年均蒸發量1 440 mm，屬濕潤半濕潤大陸季風性氣候.實驗土壤取自研究院耕地表層0～10 cm 婁土.基本肥力狀況：有機質 9.49 g/kg，全氮0.98 g/kg，速效磷25.7 mg/kg. 培栽盆選塑料盆，盆高15.8 cm，入口直徑25 cm，桶底部各打4個小孔以保持下層土壤的通氣性.為防止塑料盆漏土漏水，4孔之上墊了一層濾紙，每盆裝干土4 kg，并拌入尿素1.714 3 g、磷酸二氫鉀1.142 9 g.田間最大持水量為24%.

播種時間2013年4月9號，實驗小麥種為小偃22.每盆播入經過挑選大小基本一致的飽滿小麥籽粒15粒，共12盆，分4個處理，分別為正常(CK)對照、輕度(LS)水分脅迫處理、中度(MS)水分脅迫處理、重度(SS)水分脅迫處理. 如表1所示控水量.播種前，各處理組均灌水對照水平，小麥苗長到三葉期時，苗期處理開始，每天稱重確定灌水量，使CK，LS，MS，SS 4個處理保持在相應的水分梯度區段內.處理2周左右，開始取材使用.

表1　控水量

控水量為田間持水量θf的百比分.

1.2　氣孔導度、蒸騰速率、光合速率的測定

在天氣晴朗的上午，用LI-6400便攜式光合測定儀(美國Li-cor公司生產)測定小麥葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、胞間CO2濃度.

1.3　活性氧含量測定

1.3.1H2O2含量的測定

采用硫酸鈦沉淀法[22].

采用羥胺氧化法[22].

1.3.3丙二醛(MDA)含量測定

在不同處理下的植株上各稱取2～4 g植物葉片，加入少量石英砂和3 mL (分2次加入)質量濃度50 g/L的三氯乙酸溶液(TCA)，在經過冰浴的研缽內研磨成勻漿，轉移到離心試管中.將研缽用TCA洗凈，清洗液移入離心管中，最后用TCA定容至5 mL.在3 000g離心15 min.吸取2 mL的提取液于刻度試管中，加入質量濃度5 g/L的硫代巴比妥酸(TBA)，于沸水浴上加熱10 min(自試管內溶液中出現小氣泡開始計時)，迅速冷卻.于3 000g離心15 min.取上清液以質量濃度5 g/L的硫代巴比妥酸為空白，于450，532，600 nm波長下測定吸光度.計算MDA含量.

1.4　酶活性測量

1.4.1超氧化物岐化酶(SOD)活性測定

用氮藍四唑(NBT)光還原法[22].

1.4.2過氧化物酶(POD)活性測定

用愈創木酚法[22].

1.4.3過氧化氫酶(CAT)活性測定

用紫外吸收法[22].

1.5　H 2O 2在植物葉片中的定位

熒光探針定位: 分別徒手撕下不同處理小麥葉片下表皮3～5片，放入Mes-KCl負載緩沖液中，加入配置好的含有H2DCFDA的反應液1 μL后避光孵育15~20 min，用Mes-KCl緩沖液漂洗3次，置于載玻片上，在普通熒光顯微鏡下觀察拍照.

1.6　氣孔密度和分布的計算與觀察

在所選植株向陽面的上、中、下 3個部位各隨機選取無病蟲、無損傷的樣葉一片.采取“印痕法”在葉的背面，避開主脈及邊緣，涂上薄而均勻的一層火棉膠，面積大約1 cm2.靜置數分鐘待干成薄膜，用IM-2D型照度計測量涂火棉膠葉片當時的光照強度，并用干濕溫度計測定當時溫濕度.將處理過的樣葉帶回室內觀測.取下葉背面的火棉膠薄片用于制片，放在載玻片上，加1滴水，蓋上蓋玻片，將制成的片子置于光學顯微鏡40倍物鏡下，照相并計算氣孔的密度.

1.7　數據處理

用Origin Pro8軟件進行數據整理和作圖，用SPSS8.0 數據分析軟件進行統計分析，采用LSD 法進行差異顯著性檢驗(α=0.05).

2結果與分析

2.1　水分虧缺對小麥葉片光合特性的影響

氣孔是植物與外界環境進行物質交換的開關.干旱脅迫對氣孔的影響會反映在植物光合作用、蒸騰速率、胞間CO2濃度等生理指標上.利用LI6400便攜式光合測定儀對小麥葉片的這些生理指標進行了測定，結果如圖1所示.苗期小麥葉片的蒸騰速率、氣孔導度、胞間CO2濃度及其凈光合速率，都隨著干旱脅迫的加劇呈逐漸下降的趨勢.總體而言，在CK和LS情況下，水分處理對上述光合作用的指標作用不顯著.而LS和MS以及MS和SS間一般都呈現出了顯著性差異.

不同字母表示組間有顯著性差異

2.2　水分虧缺對小麥葉片氣孔密度的影響

氣孔密度會隨著環境的變化而出現與之相適應的變化.從圖2看出，隨著干旱脅迫程度的增加，苗期各處理組氣孔密度逐漸增加.與苗期正常對照相比，LS處理增加7.03%，MS和SS處理氣孔密度較CK增加較多，分別為36.29%和44.12%.此外還觀察到，CK條件下的氣孔排列較整齊，呈多列狀排列；隨著干旱脅迫的加劇，氣孔的分布越來越不規律.

不同字母表示組間有顯著性差異 圖2　水分處理對氣孔密度的影響 Fig.2　Effect of treatment on stomatal density

2.3　水分虧缺對小麥葉片過氧化程度的影響

實驗結果如圖3所示，統計分析發現，水分處理對H2O2、超氧陰離子和MDA含量的影響是顯著的.這3種物質都呈現出了隨干旱加劇其含量顯著上升的趨勢. H2O2是生物體內最穩定的活性氧(ROS)分子，因此植物體內H2O2的多少可以反映出植物體內ROS積累情況.超氧陰離子也是一種重要的活性氧自由基，它可以被超氧歧化酶轉化為H2O2，因此植物體內超氧陰離子的含量也可以反映出植物體內活性氧的積累情況.如圖3所示，苗期輕度(LS)、中度(MS)、重度(SS)干旱脅迫比正常對照(CK)的H2O2含量分別升高了8.91%，38.12%，79.62%.類似地，隨著干旱脅迫的加重，苗期玉米葉片中超氧陰離子和MDA的含量也呈增長趨勢.

不同字母表示組間有顯著性差異

2.4　水分虧缺對小麥葉片保護酶活性的影響

不同字母表示組間有顯著性差異

2.5　水分虧缺對小麥葉片氣孔中H 2O 2含量和分布的影響

如圖5所示，在CK，LS和MS情況下，H2O2集中在表皮氣孔中，在其他部位沒有分布，且濃度隨著干旱脅迫的加劇逐漸上升.在SS情況下，維管束和表皮細胞中的H2O2含量急劇上升，分析認為是脅迫導致的過氧化作用加強所致.

圖5　水分處理對H 2O 2分布的影響

3討論與分析

4結論

本實驗通過生理指標檢測和化學熒光定位方法，發現小麥通過調節氣孔密度、氣孔分布和氣孔導度等方式來控制水分的散失.隨著干旱脅迫的加劇，氣孔分布越來越不規律，氣孔導度也有所下降.水分脅迫會導致小麥葉片的光合作用降低，體內ROS含量上升，影響植物光合及生長，從而引起葉面積減小，氣孔密度增加.與此同時，植物會通過增加合成過氧化物保護酶，降低氣孔導度蒸騰速率等響應干旱脅迫的影響. 實驗發現，小麥葉片中活性氧主要分布在維管束、氣孔的保衛細胞和副衛細胞中，且其濃度隨著脅迫的加劇而上升.此研究為研究小麥響應脅迫機理提供了實驗支持，為解決旱區農業作物種植提供了理論指導.

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(責任編輯：趙藏賞)