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(1.第四軍醫大學口腔醫院正畸科，軍事口腔醫學國家重點實驗室，陜西西安710032; 2.解放軍75220部隊醫院，廣東潮州

521000;3.解放軍第461醫院口腔正畸科，吉林長春130000;4.川北醫學院附屬醫院，四川南充637000)

【摘要】目的:探討饑餓條件下自噬與凋亡在小鼠成骨細胞中的發生情況與相互關系。方法:培養初代MC3T3-E1小鼠成骨細胞系，將其分為饑餓誘導組與3-甲基腺素(3-MA)預處理饑餓誘導組。其中，饑餓誘導組采用單純饑餓誘導法，用厄爾氏平衡鹽溶液(earle’s balanced salt solution，EBSS)培養1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。3-MA是一種特異性自噬抑制劑，在3-MA預處理饑餓誘導組中，正常培養的小鼠成骨細胞加入3-MA預處理1 h后，再用EBSS平衡鹽溶液培養1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。應用透射電子顯微鏡觀察饑餓誘導組小鼠成骨細胞自噬與凋亡的形態學變化，應用Western blot免疫印跡法和Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測小鼠成骨細胞中自噬相關蛋白LC3，凋亡相關蛋白caspase 3表達水平的變化。結果:透射電鏡結果顯示單純饑餓誘導條件下，細胞在2 h前以自噬為主，2 h后以凋亡為主，并隨著時間的延長，凋亡水平逐漸增高。Western blot免疫印跡法結果顯示與饑餓誘導組相比，3-MA預處理饑餓誘導組的LC3轉化水平在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h都出產生了明顯的下降趨勢(P＜0.05); caspase 3蛋白表達水平在1 h、2 h、3 h和4 h增高(P＜0.05)，但0 h、5 h和6 h無差異(P＞0.05)。Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測結果和單純饑餓誘導組相比，3-MA預處理組僅在1 h、2 h、3 h和4 h促進了細胞凋亡(P＜0.05)，而并未影響到0 h、5 h和6 h的細胞凋亡(P＞0.05)。結論:饑餓發生后，小鼠成骨細胞的自噬作用通過降低caspase 3的活化水平，在細胞饑餓2 h前拮抗凋亡作用，隨著饑餓時間的不斷延長，細胞自噬的表達水平在3 h 和4 h時不斷下降，自噬對細胞的保護不斷降低，最終走向凋亡，此時自噬對凋亡的發生將不再有任何作用。

牙周組織改建是正畸牙齒移動的基礎，有研究表明:在施加正畸矯治力初期，牙周組織發生改建，壓力側牙槽骨在正畸力作用下管徑減小，毛細血管數及血供減少，從而使壓力側牙槽骨成骨細胞處于一個低氧、營養缺乏的饑餓環境中，這種刺激可誘導細胞發生死亡［1］。細胞的正常死亡包括兩種方式:自噬性程序性死亡和凋亡性程序性死亡［2］。然而，自噬和凋亡在細胞死亡的過程中所扮演的角色目前還存在爭議。有研究報道自噬通過分解代謝為細胞提供養分拮抗凋亡，延長細胞在代謝應激期間的存活;但同時也有研究證實自噬作為一種死亡機制協同凋亡促進細胞死亡，在不同的細胞中及不同的狀態下自噬將發揮不同的作用［3-4］。在正畸壓力側牙槽骨成骨細胞的死亡中，自噬到底抑制了成骨細胞的生存還是促進了細胞死亡都尚不明確;另一方面，成骨細胞在饑餓死亡過程中，自噬、凋亡的發生情況及相互關系目前未見文獻報道［5］。厄爾氏平衡鹽溶液(Earle's balanced salt solution，EBSS)饑餓誘導法是目前自噬誘導的經典方法，EBSS平衡鹽緩沖液內無氨基酸與血清，能維持細胞一定的代謝基本需要，是饑餓誘導自噬發生常用試劑［6］。3-甲基腺素(3-MA)是一種特異性自噬抑制劑［7］，可通過與常規饑餓誘導細胞的對比，更好的表明自噬與凋亡的相互關系。本研究通過饑餓誘導條件下成骨細胞自噬與凋亡表達的水平變化和相互關系，初步分析自噬和凋亡對正畸牙齒移動過程中牙槽骨改建的作用，為完善正畸力作用下牙周組織改建的生物學機制提供參考。

1　材料與方法

主要儀器: mini protean 3 cell電泳儀購自美國BIO-RAD公司，Olympus-BH-2型光學顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國Becton Dickson公司，Zeiss Axioimager M1型顯微鏡購自德國ZEISS公司。主要試劑:新生胎牛血清、胰蛋白酶、α-MEM培養基購自HyClone公司; 3-甲基腺素(3-MA)、EBSS由Gibco公司購買;鼠抗人多克隆抗體微管相關蛋白l輕鏈3(LC3)、鼠抗人多克隆抗體caspase3(含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶)購自美國Cell Signaling Technology公司; Annexin V/PI試劑盒從南京凱基生物制品公司購買; RIPA細胞裂解液、山羊抗兔HRP-標記二抗自上海基爾頓公司購得。

小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1初代由ATCC購買，α-MEM培養液中加入HyClone 10％胎牛血清作為細胞培養基，細胞培養箱各項指標: 37℃、CO2含量(為5％)、飽和濕度。當細胞在培養皿中生長于鏡下觀察處于對數生長期后，去除原培養液，預熱PBS漂洗，以EBSS培養液誘導細胞饑餓狀態。3-MA預處理組細胞饑餓前1 h加入5 mmol/L 3-MA預處理，用以抑制饑餓誘導的自噬。

取生長良好的小鼠成骨細胞隨機分為兩組: EBSS饑餓誘導組以EBSS培養液替代常規細胞培養液進行培養，饑餓誘導不同時間，分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。3-MA預處理組細胞饑餓誘導前1 h加入5 mmol/L 3-MA預處理，隨后用EBSS培養液培養，分別進行饑餓誘導1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。兩組組內空白對照均為含10％胎牛血清的α-MEM培養基培養正常小鼠成骨細胞。

1.4透射電子顯微鏡觀察饑餓誘導組小鼠成骨細胞自噬體、凋亡小體的出現順序和數量的變化

取EBSS饑餓誘導各組細胞，胰蛋白酶消化離心，加入戊二醛固定12 h以上，鋨酸再次固定，醋酸鈾染色，梯度乙醇脫水，樹脂包埋，用LKB-V超薄切片機以0.1 um厚度切片，最后經檸檬酸鉛染色，于透射電子顯微鏡下觀察細胞各細胞器結構，分析各分組中自噬體和凋亡的典型形態學變化。

各組實驗處理后的細胞離心、收集、漂洗，加入Binding Buffer制備成細胞懸液。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后再加入10 μL PI，室內溫度下避光反應5～15 min。最后再加入Binding Buffer，上機檢測細胞凋亡狀況。用流式細胞儀檢測的激發波長Ex為488 nm，發射波長Em為530 nm。經雙變量流式細胞儀檢測，其散點圖結果中B1區為壞死細胞，在本實驗中代表因自噬而導致死亡的細胞; B2區表示凋亡晚期細胞; B3區表示正常活細胞; B4區表示凋亡早期細胞。每組實驗重復3次。凋亡細胞所占百分比可用以下公式計算獲得:凋亡細胞所占百分率= (B2 + B4)％。

取各組實驗處理后細胞，加入適量蛋白酶抑制劑(PMSF)，然后重懸于細胞裂解液(RIPA)中，冰上裂解20 min同時超聲裂解3次，以12 000 rpm、4℃條件下離心15 min，吸取的上清液為總蛋白液，將其移入1.5 mL離心管中，蛋白總濃度用BCA法測定，SDS-PAGE電泳分離;然后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入BSA稀釋后的一抗孵育過夜，5％脫脂奶粉洗去多余抗體，加入HRP標記的山羊抗兔IgG室溫下搖振孵育2 h;最后加入ECL試劑，暗盒X光膠片顯影，膠片經計算機掃描檢測蛋白表達情況。所有條帶灰度值輸入Graph Pad軟件進行分析，并形成圖表。每組實驗重復3次，分析不同分組間細胞自噬與凋亡表達水平的變化及其相互關系。

實驗所有數據輸入SPSS19.0統計學軟件分析，EBSS饑餓誘導組各時間點試驗樣本數據比較采用方差檢驗統計分析; EBSS饑餓誘導組與3-MA預處理組在同一時間點兩組組間數據比較采用t檢驗統計分析; P＜0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

空白對照組小鼠成骨細胞胞核形態完整，核內明顯核仁結構，細胞核位于細胞內一側，胞漿內可見大量粗面內質網和高爾基復合體; 1 h組細胞胞漿內分布大量雙層膜結構囊泡，囊泡內包裹線粒體、核糖體等細胞器，根據其形態結構可判定為為自噬體空泡;2 h組可見大量細胞出現凋亡染色質凝集，細胞核呈新月形邊棘; 3 h組細胞內觀察到凋亡凝集染色質和自噬小體共存; 4 h組可見大量凋亡細胞核; 5 h組凋亡細胞核破碎，出現凋亡小體;6 h組出現大量凋亡小體。由此可見，在EBSS饑餓誘導條件下，小鼠成骨細胞死亡方式在2 h前以自噬為主，2 h后以凋亡為主，并隨著時間的延長，凋亡水平逐漸增高(圖1)。

Western blot實驗顯示，饑餓會同時導致細胞產生自噬和凋亡現象，兩者之間存在著以時間為聯系的相互關系。其中各EBSS饑餓誘導組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均大于空白對照組(P﹤0.05)，經EBSS饑餓誘導1 h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值開始上升，2 h組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值到達最大值(P﹤0.05)，自噬達到高峰，隨后自噬水平開始下降(P﹤0.05)，caspase3蛋白表達水平隨時間逐漸升高(P﹤0.05)，明顯的凋亡高峰在4 h當自噬下降時被觀察到(圖2)。與EBSS饑餓誘導組相比，3-MA預處理組的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化水平在除0 h外的其他時間點均出現明顯下降(P＜0.05)。比較caspase3蛋白表達水平發現，3-MA預處理組與單純饑餓誘導組相比僅上調了1 h、2 h、3 h和4 h的caspase3蛋白表達水平(P＜0.05)，而并不影響0 h、5 h和6 h的caspase3蛋白表達水平(P＞0.05)，見圖3。

圖2　單純饑餓誘導不同時間小鼠成骨細胞自噬與凋亡變化水平Western blot檢測結果與分析

圖3　3-MA預處理組與EBSS饑餓誘導組自噬與凋亡變化水平Western blot檢測結果分析與對比

空白對照組細胞凋亡量均小于各饑餓誘導組(P﹤0.05)，各饑餓誘導組的細胞凋亡量隨時間的上升而增高，6 h達到最大值(P﹤0.05)(圖4)。比較3-MA預處理組和EBSS饑餓誘導組的細胞凋亡量(B2 + B4)％發現，3-MA預處理僅在1 h、2 h、3 h和4 h促進了細胞凋亡(P＜0.05)，而并未影響到0 h、5 h和6 h的細胞凋亡(P＞0.5)，這與之前的Western blot檢測結果一致(圖5)。

圖5　3-MA預處理組與EBSS饑餓誘導組細胞Annexin V-FITC/PI雙標法檢測凋亡結果分析與對比

3　討論

細胞死亡包括3種類型:自噬、凋亡和壞死［2］。凋亡屬于I型程序性細胞死亡，依賴于caspase，表現為細胞間連接消失，細胞體積縮小，胞質密度增加，線粒體通透性改變，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解，最終分隔為幾個凋亡小體被巨噬細胞所吞噬［2］。自噬性細胞死亡屬于II型程序性細胞死亡，以自噬體的出現為特征，不依賴于caspase，自噬是指細胞內的溶酶體降解自身細胞器和其他大分子的過程［8-9］。自噬對細胞內環境的穩態和細胞生存至關重要，當細胞在缺乏營養或發生應激反應時，可誘發自噬現象［10-11］。自噬和凋亡無論在形態學還是生化代謝途徑方面都有著明顯的區別，但有研究證實，二者在功能上存在聯系，即自噬為凋亡所需，自噬通常發生在凋亡之前，進而啟動凋亡;自噬也可抑制凋亡，保護細胞免于發生凋亡和壞死;自噬可以向凋亡轉化，共同促進細胞死亡［3-4］。目前研究顯示，自噬與腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等許多病變有密不可分的關系［12-14］。Foster［15］認為矯治力作用后，壓力側牙周膜內液壓升高，牙周膜血管內的血液減少，達到液壓平衡，最后壓力側血管狹窄，血流量減少，同時該區域血管密度和面積均減小。那么當施加正畸矯治力導致壓力側血供減少，營養缺乏，成骨細胞處于饑餓環境，繼而發生死亡。成骨細胞的死亡過程中自噬與凋亡的發生情況如何?兩者是怎樣的關系?針對這些問題本研究通過饑餓誘導法，使MC3T3-E1細胞處于饑餓環境，誘導自噬與凋亡的發生，并使用3-MA自噬抑制劑抑制自噬，觀察自噬對凋亡的影響，利用透射電子顯微鏡定性分析小鼠成骨細胞自噬與凋亡的形態學變化，應用Western blot免疫印跡法和Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術定量分析小鼠成骨細胞中自噬相關蛋白LC3，凋亡相關蛋白caspase 3表達水平的變化。

從透射電子顯微鏡這一自噬檢測金標準中觀察到EBSS饑餓誘導組1 h可見自噬體，2 h出現凋亡染色質凝集，3 h觀察到自噬體與凋亡細胞核共存，4 h、5 h、6 h細胞只出現凋亡小體，并隨時間延長而增多。這證明了饑餓導致小鼠成骨細胞發生自噬與凋亡，早期以自噬為主，隨著時間的延長逐漸走向凋亡。LC3蛋白作為自噬檢測的的標志蛋白，LC3-I和LC3-II是它的兩種不同表達形式，當細胞因外界刺激從而發生自噬時，細胞內LC3的總含量及LC3-I 向LC3-II的轉化量將會明顯增多; caspase3蛋白是真核細胞發生凋亡的標志性蛋白之一，與細胞的生長、分化及凋亡調節密切相關，當細胞發生凋亡，caspase3蛋白含量增高。Western blot實驗結果顯示饑餓同時誘導細胞產生自噬和凋亡反應，兩者之間存在著以時間為聯系的相互關系。在饑餓2 h期間，自噬達到高峰，隨后自噬水平開始下降，明顯的凋亡高峰在4 h當自噬下降時被觀察到。由TEM和WB結果，我們已經知道饑餓引起的細胞死亡呈時間依賴性升高，為了進一步弄清自噬和凋亡在細胞死亡中所起的作用，明確在饑餓引起的細胞死亡中，自噬有沒有起到作用，引入了Annexin V FITC/PI雙標法，通過分析細胞壞死率，發現在饑餓誘導各分組都沒有發現細胞壞死性死亡率有明顯變化(P＞0.05)，因為自噬小體的產生是自噬性細胞死亡的典型形態特征。綜合以上數據我們可以得知饑餓導致的細胞死亡中，自噬性細胞死亡并不占主導地位。因為自噬與凋亡在發生時間上具有先后順序性，這一順序性說明饑餓早期自噬對凋亡的發生可能具有拮抗作用。為了驗證這一假設，引入了3-MA預處理細胞抑制自噬，重新檢測LC3和caspase3活化水平，Western blot實驗結果顯示3-MA預處理組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與單純饑餓誘導組相比，在除0 h外的其他時間點下降趨勢明顯，比較caspase3蛋白表達水平發現3-MA預處理組與單純饑餓誘導組相比僅上調了1 h、2 h、3 h和4 h的caspase3蛋白表達水平，而并不影響0 h、5 h和6 h的caspase3蛋白表達水平。Annexin VFITC/PI雙標記流式細胞術檢測結果顯示比較3-MA預處理組和單純饑餓誘導組的細胞凋亡量(B2 + B4)％發現，3-MA預處理僅在1 h、2 h、3 h和4 h促進了細胞凋亡，而并未影響到0 h、5 h和6 h的細胞凋亡，這與之前的Western blot檢測結果一致。本實驗結果證明當饑餓發生后，小鼠成骨細胞首先啟動自噬機制，在2 h前拮抗caspase 3的活化，避免凋亡發生，隨著饑餓時間的延長，饑餓狀態不斷加劇，細胞自噬作用在3 h和4 h連續下降，自噬對細胞的保護作用也隨之降低，細胞不可避免的發生凋亡，自噬對凋亡的影響最終消失。caspase3導致的凋亡一般被定義為由于內質網(endoplasmic reticulum，ER)壓力不斷增大從而誘導凋亡產生。細胞內的蛋白質合成和折疊都是在內質網內完成，而應激狀況導致內質網蛋白折疊壓力不斷增大，非折疊蛋白增多。有研究證明自噬分解非折疊蛋白除了提供ATP外，還能緩解ER壓力［16-17］。綜合上述觀點，我們推測在MC3T3-E1細胞中，在饑餓導致的應激狀態下，非折疊蛋白增多，細胞通過自噬反應不斷分解，從而延緩了凋亡的發生，可這種情況無法持久，細胞內部對非折疊蛋白的自噬作用一但達到飽和，凋亡即不可避免的隨之來臨。而細胞內部如何吞噬非折疊蛋白，又是通過何種機制來延緩凋亡發生的都還需要進一步研究。

［1］Vandevska-Radunovic V，Kristiansen AB，Heyeraas KJ，et al.Changes in blood circulation in teeth and supporting tissues incident to experimental tooth movement［J］.Eur J Orthod，1994，16(5):361-369.

［2］Schweichel JU，Merker HJ.The morphology of various types of cell death in prenatal tissues［J］.Teratology，1973，7(3):253-266.

［3］Kang C，You YJ，Avery L.Dual roles of autophagy in the survival of Caenorhabditis elegans during starvation［J］.Genes Dev，2007，21 (17):2161-2171.

［4］Espert L，Denizot M，Grimaldi M，et al.Autophagy is involved in T cell death after binding of HIV-1 envelope proteins to CXCR4［J］.J Clin Invest，2006，116(8):2161-2172.

［5］周云，付秀莉，高遠，等.饑餓誘導環境下人牙周膜成纖維細胞的自噬作用研究［J］.陜西醫學雜志，2014，43(2):152-154.

［6］Kroemer G，Marino G，Levine B.Autophagy and the integrated stress response［J］.Mol Cell，2010，40(2):280-293.

［7］喻琴琴，楊俊，李馨欣.自噬及其抑制劑的研究進展［J］.實用醫學雜志，2013，29(17):2908-2910.

［8］Tsukada M，Ohsumi Y.Isolation and characterization of autophagydefective mutants of Saccharomyces cerevisiae［J］.FEBS Lett，1993，333(1-2):169-174.

［9］Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease ［J］.Cell，2008，132(1):27-42.

［10］Colell A，Ricci JE，Tait S，et al.GAPDH and autophagy preserve survival after apoptotic cytochrome c release in the absence of caspase activation［J］.Cell，2007，129(5):983-997.

［11］Lee J，Giordano S，Zhang J.Autophagy，mitochondria and oxidative stress: cross-talk and redox signalling［J］.Biochem J，2012，441 (2):523-540.

［12］Friedhuber AM，Chandolu V，Manchun S，et al.Nucleotropic doxorubicin nanoparticles decrease cancer cell viability，destroy mitochondria，induce autophagy and enhance tumour necrosis［J］.J Pharm Pharmacol，2015，67(1):68-77.

［13］Marcuzzi A，Bianco AM，Girardelli M，et al.Genetic and functional profiling of Crohn＇s disease: autophagy mechanism and susceptibility to infectious diseases［J］.Biomed Res Int，2013，doi: 10.1155/2013/297501.

［14］Rovetta AI，Pena D，Hernandez DPR，et al.IFNG-mediated immune responses enhance autophagy against Mycobacterium tuberculosis antigens in patients with active tuberculosis［J］.Autophagy，2014，doi:10.4161/15548627.2014.981791.

［15］Foster TD.A textbook of orthodontics［M］.Oxford: Blackwell，1975:356.

［16］Kim I，Xu W，Reed JC.Cell death and endoplasmic reticulum stress: disease relevance and therapeutic opportunities［J］.Nat Rev Drug Discov，2008，7(12):1013-1030.

［17］Rasheva VI，Domingos PM.Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis［J］.Apoptosis，2009，14 (8): 996-1007.

Study on the interaction between autophagy and apoptosis of MC3T3-E1 at starvation state

(1.State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Orthodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi’an，710032 Shaanxi;2.75220th Hospital of PLA，Chaozhou 521000，Guangdong;3.Department of Orthodontics，461th Department of Orthodontics，Changchun 130000，Jilin;4.Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To explore the interaction between autophagy and apoptosis of MC3T3-E1 at starvation state.Methods: MC3T3-E1 of 3-MA group was pretreated with 3-MA for 1 hour before being cultured in earle’s balanced salt solution(EBSS)for another 6 hours，and the samples without 3-MA pretreatment were taken as starvation group.MC3T3-E1 of different groups were sampled hourly.The morphological change of MC3T3-E1 form starvation group was observed by TEM.To determine the expression of LC3 and caspase 3，western blot and flow cytometry were performed.Results: The observation of TEM showed that MC3T3-E1 from starvation group was dominated by autophagy in the first two hours of the 6-hours period cultured in EBSS，whereas apoptosis was the main process after the first two hours and the level increased with time.The observation of western blot showed that，compared with those from starvation group，MC3T3-E1 from 3-MA group presented a reduced LC3 expression level (P＜0.05)throughout the 6-hours period，and anbook=207,ebook=81enhanced caspase 3 expression level in the first 4 hours (P＜0.05)，while there was no difference observed between the two groups (P＞0.05)in the last 2 hours(P＞0.05).The observation of flow cytometry showed that，compared with those from starvation group，MC3T3-E1 from 3-MA group presented an enhanced apoptosis level in the first 4 hours (P＜0.05)，while there was no difference observed between the two groups (P＞0.05)in the last 2 hours(P＞0.05).Conclusion: Under starvation condition，autophagy of MC3T3-E1 may antagonize apoptosis in the first 2 hours by inhibiting the activity of caspase 3.While the autophagy level reduces in the middle 2 hours，apoptosis may not be affected by autophagy.

作者簡介:朱文胤(1983-)，男，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事正畸學方面的研究。

網絡出版時間: 2015-5-1 01∶33網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150501.1333.016.html

饑餓誘導下小鼠成骨細胞自噬與凋亡相互作用研究

1 材料與方法

2 結果

3 討論

1　材料與方法

2　結果

3　討論