在煙草中過量表達大豆SGF14a增強轉基因煙草對鋁脅迫的耐受性

在煙草中過量表達大豆SGF14a增強轉基因煙草對鋁脅迫的耐受性

楊志麗, 郭傳龍, 劉蕾, 武孔煥, 王琳, 李昆志, 趙艷, 陳麗梅

(昆明理工大學生命科學與技術學院生物工程技術研究中心,昆明650500)

摘要為了驗證鋁耐受型丹波黑大豆根尖14-3-3a基因(soybean 14-3-3a,SGF14a)在植物應答鋁脅迫中的作用,本研究利用35S組成型啟動子和大豆SGF14a的編碼區構建植物表達載體pK-35S-SGF14a,在野生型(wild type,WT)煙草中過量表達SGF14a獲得3個轉基因株系(S11、S19和S23);并用50 μmol/L鋁處理WT和轉基因煙草,分析過量表達SGF14a對煙草鋁耐受性的影響.結果表明:過量表達SGF14a的轉基因煙草經鋁脅迫處理后根的相對生長量比WT高約30%～40%;此外,在沒有鋁脅迫的正常生長條件下,3株轉基因煙草根中可溶性蛋白的含量都比WT高,而用50 μmol/L鋁脅迫24 h后WT煙草和3株轉基因煙草根中可溶性蛋白的含量都下降,但轉基因煙草根中可溶性蛋白含量仍顯著高于WT,并且過量表達SGF14a還可顯著提高過氧化物酶、過氧化氫酶以及抗壞血酸過氧化物酶的活性,降低鋁脅迫下煙草根中過氧化氫(H2O2)的積累以及氧化脅迫的水平;同時,轉基因煙草在低酸土壤中的生長狀況也明顯優于WT。這說明過量表達SGF14a可增強煙草對鋁脅迫的耐受性及其適應酸性土壤生長的能力。

關鍵詞14-3-3蛋白; 過量表達; 轉基因煙草; 鋁脅迫; 耐鋁性

中圖分類號Q 786文獻標志碼A

基金項目:國家自然科學基金(30970263)。

收稿日期(Received):2014-09-28;接受日期(Accepted):2015-02-03;網絡出版日期(Published online):2015-05-19

Overexpression of soybeanSGF14aenhanced tolerance of transgenic tobacco plants to aluminum stress. Journal of ZhejiangUniversity(Agric. & LifeSci.), 2015,41(3):285-292

Yang Zhili, Guo Chuanlong, Liu Lei, Wu Konghuan, Wang Lin, Li Kunzhi, Zhao Yan, Chen Limei*(BiotechnologyResearchCenter,FacultyofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China)

SummaryApproximately 30% of the global arable land in the world is acidic soils (pH<5) and China’s acidic soil accounts for more than 21% of the area. Aluminum (Al) toxicity is a major limiting factor which limited crop production in acid soils. Al firstly inhibits the growth and development of plant roots. Consequently, it decreased the absorption of water and nutrients, which results in poor growth and production of plants. Therefore, in recent years, many researchers dedicated to study Al tolerance mechanisms and bred high Al-tolerant and acid soil-resistant crops by genetic engineering. 14-3-3 proteins are a group of highly conserved regulatory proteins found in eukaryotic cells, and have roles in regulating plant development and stress responses. A lot of 14-3-3 gene family members are isolated in different plants. 14-3-3 proteins regulate various physiological activities and functions by interacting with phosphorylated or non-phosphorylated target proteins in plants. The expression levels of certain 14-3-3 gene isoforms can be adjusted directly by environmental stimuli.

Our previous study showed that Al stress induced the expression of 14-3-3a (SGF14a) in the Al resistant soybean (Glycinemax) root tips. In order to further validate the role ofSGF14ain response to Al stress in plants, plant expression vectors ofSGF14awere constructed. Now, the 35S constitutive promoter was used to overexpressSGF14a. We constructed pK-35S-SGF14aplant expression vectors using gateway technology, then introduced theSGF14aexpression vectors intoAgrobacteriumpMP105, which was transformed into tobacco plants via transformation method. The plants were selected by genomic polymerase chain reaction (PCR), reverse transcriptase-PCR and Western blot analysis. Finally we got three transgenic lines (S11, S19, and S23). The wild type (WT) and transgenic tobacco plants (S11, S19, S23) were treated with 50 μmol/L Al to analyze the effect ofSGF14aoverexpression on the Al-resistance of tobacco. Changes of the relative root growth, H2O2, malondialdehyde (MDA), soluble protein contents as well as antioxidant enzyme activities in transgenic plants were compared.

The results showed that the relative root growth of the transgenic plants increased approximately 1.5-fold as compared with the WT. Moreover, the soluble protein contents in the transgenic tobacco roots increased significantly compared with the WT plants, and antioxidant enzyme activities (peroxidase, catalase, and ascorbate peroxidase) in roots of transgenic tobacco plants also increased when exposed to 50 μmol/L Al. Moreover, the H2O2accumulation and oxidative stress level in transgenic tobacco roots were reduced under the Al stress. The growth status of the transgenic tobacco was better than that of WT when grown in acidic soil.

In summary, the evidences suggest that overexpression ofSGF14aan enhance the Al-tolerance of transgenic tobacco and its ability to adapt to acidic soil.

Key words14-3-3 protein; overexpression; transgenic tobacco; aluminum stress; aluminum tolerance

14-3-3蛋白能與磷酸化的靶蛋白相互作用從而調節很多生物過程,如代謝、生長、發育和信號傳導途徑[1]。很多研究結果證明植物14-3-3蛋白通過參與赤霉素(gibberellin)、脫落酸(abscisic acid)和乙烯(ethylene)等激素信號通路來調控植物生長發育過程[1]。14-3-3蛋白對植物體內物質代謝也有重要的調控作用,它通過調節硝酸還原酶(nitrate reductase)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)等代謝酶的活性來調控植物體內碳氮代謝過程[2]。此外,14-3-3蛋白還通過調節質膜中的K+泵和質膜H+-ATP酶(plasma membrane H+-ATPase,PM H+-ATPase)的活性來維持細胞內外電化學梯度,調控植物體內的物質運輸和氣孔開閉等[1]。

很多研究發現環境脅迫的刺激能直接改變14-3-3基因的某一個特異異構型的表達水平,因此14-3-3蛋白能夠參與植物對鹽、磷缺乏、干旱、冷害和重金屬等多種非生物脅迫和病原菌侵染等生物脅迫的應答[3]。ukaszewicz等[4]通過基因工程的手段改變14-3-3蛋白的表達來研究其功能,結果表明在馬鈴薯中過量表達14-3-3蛋白能夠改變脂類、氨基酸和礦物質的組成,并且提高其抗氧化脅迫的能力,而抑制14-3-3蛋白的表達則出現相反的結果。在水稻中過量表達玉米的14-3-3基因(ZmGF14-6)后能夠增強水稻的抗旱能力[5],在棉花中過量表達擬南芥的14-3-3基因(GF14λ)后能夠使棉花保持“常青”的表型并增強棉花對干旱脅迫的耐受性[6]。通過反義技術抑制擬南芥14-3-3蛋白的表達,可促進葉片中淀粉的積累并增加轉基因植物的生長[7]。

全世界大約有30%的可耕地屬于酸性土壤,鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一[8]。鋁毒早期最明顯的癥狀是抑制根尖細胞生長和細胞分裂,從而抑制根的生長,導致根系損傷,影響水分和養分的吸收,限制植物的生長。低磷和鋁脅迫均誘導擬南芥、羽扇豆、蠶豆和大豆中某些14-3-3異構型的表達[9-11]。本課題組[11]前期研究表明鋁脅迫可誘導耐鋁型丹波黑大豆(resistant soybean,RB)根尖14-3-3a基因(SGF14a)的表達,為了驗證SGF14a在植物應答鋁脅迫中的作用,本研究通過通路克隆技術(Gateway)構建SGF14a的植物表達載體,轉化煙草產生SGF14a過量表達株系,考察過量表達大豆SGF14a對煙草鋁耐受性的影響,為提高植物耐鋁能力的基因工程手段操作提供基因資源和操作策略。

1材料與方法

1.1煙草的培養

野生型(wild type,WT)煙草種子(Nicotianatabacumcv. Xanthi)消毒后,播種于MS固體培養基(Murashige-Skoog media)中,待種子發芽后進行繼代培養,獲得無菌煙草幼苗用于轉基因操作。

1.2植物表達載體的構建

本研究利用通路(Gateway)克隆技術構建目的基因SGF14a的植物表達載體,構建策略如圖1所示。首先根據GenBank數據庫上發表的大豆14-3-3a基因(SGF14a)的cDNA編碼區序列設計上游特異引物P1:5′-AAGCTTATGTCGGATTCTTCTC GGGAGGAG-3′(含HindⅢ酶切位點)和下游特異引物P2:5′-CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTT GCTTAGAT-3′(含XhoⅠ酶切位點),然后提取RB大豆根總RNA,反轉錄為cDNA。以反轉錄的cDNA為模板,用帶有合適酶切位點的SGF14a基因上、下游引物進行PCR擴增,獲得SGF14a基因cDNA編碼區全長DNA片段,然后亞克隆于TA克隆載體pMD18-T(大連寶生物有限公司)中獲得pMD18T-SGF14a載體,對獲得的陽性克隆進行測序,檢測外源基因SGF14a是否發生突變,再用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切pMD18T-SGF14a和Gateway的入門載體pENTR(購于美國Invitrogen公司),將SGF14a基因cDNA編碼區亞克隆到pENTR載體上,產生入門克隆載體pENTR-SGF14a。最后進行LR反應,(含有attL的入門克隆和attR位點的目的載體DNA分子發生重組反應),在LR重組酶的作用下,入門克隆載體pENTR-SGF14a和表達載體pK2GW7(購自比利時VIB/Gent公司)進行LR反應,發生重組反應產生SGF14a的植物表達載體,簡稱pK-35S-SGF14a。LR反應按照LR反應試劑盒(LR ClonaseTMplus enzyme mix)(Invitrogen公司)說明書進行,反應混合液混勻后于25 ℃反應過夜,轉化大腸埃希菌感受態細胞DH5(購于天根生化科技有限公司),在含有50 μg/mL大觀霉素(spectinomycin,Spe)的LB平板上篩選重組克隆,獲得植物表達載體pK-35S-SGF14a。

pMD18-T:TA克隆載體;pENTR:入門載體;pK2GW7:植物表達載體;(HindⅢ,XhoⅠ,XmnⅠ,SalⅠ,BamHⅠ,KpnⅠ,ExoRⅠ,NotⅠ,SalⅠ,EcoRⅤ):限制性酶切位點;(Amp r,Km r,Spe r):篩選標記基因;LacZ:報告基因;Origin:起始位點;35S:組成型啟動子;(attR1、attR2和attL1、attL2):附著點(attachment site,att)的重組位點;ccdB *:負選擇細菌病毒性基因;(RB和LB):右邊界序列和左邊界序列. 　　pMD18-T: TA cloning vector; pENTR: Entry vector; pK2GW7: Plant expression vector; (HindⅢ, XhoⅠ, XmnⅠ,SalⅠ, BamHⅠ, KpnⅠ, ExoRⅠ, NotⅠ, SalⅠ, EcoRⅤ): Restriction enzyme sites; (Amp r, Km r, Spe r): Marker genes for plant selection; LacZ: Reporter gene; Origin: Initiation sites; 35S: Constitutive promoter; (attR1,attR2 and attL1, attL2): att recombination sites; ccdB *: Bacterial toxin gene for negative selection; (RB and LB): Right border sequence and left border sequence, respectively. 圖1　植物表達載體pK-35S-SGF14a構建示意圖 Fig.1　Diagram of the construction of plant expression vector pK-35S-SGF14a

1.3煙草的轉化及轉基因煙草的篩選

通過電轉化法將植物表達載體pK-35S-SGF14a轉入農桿菌中,在含有Spe的平板上篩選得到陽性克隆,經菌液PCR檢測證實含有pK-35S-SGF14a的陽性克隆用于煙草的轉化。通過農桿菌介導的葉盤轉化法轉染WT煙草,將轉染后的葉片轉移到含有卡那霉素(kanamycin,Km)和頭孢噻肟鈉(cefotaxine,Cef)的芽誘導培養基(MS4)上誘導外植體發芽,約15 d繼代1次。待芽長大后從外植體上切下轉入含Km和Cef的生根培養基上誘導根的生長,得到抗Km的煙草植株。

1.4轉基因煙草的基因組PCR和逆轉錄PCR檢測

用CTAB法從煙草葉片中提取基因組DNA作為模板,分別用SGF14a的上、下游特異引物進行PCR擴增,檢測SGF14a在轉基因煙草基因組中的整合情況。用試劑TRIzol?提取煙草根的總RNA,取3 μg的總RNA用逆轉錄酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLVRT)反轉錄合成cDNA,用SGF14a的上、下游特異引物進行逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),以檢測SGF14a的轉錄水平(TRIzol?試劑和M-MLVRT均購于大連寶生物有限公司)。

1.5蛋白質印跡法(Western blot)分析

用蛋白抽提液Tris-HCl 50 mmol/L,10%甘油,β-巰基乙醇10 mmol/L,苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)1 mmol/L,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)2 mmol/L,10%不溶性聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)提取煙草根的可溶性蛋白,通過考馬斯亮藍法(Bradford)測定蛋白含量,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE:12%分離膠和4%濃縮膠,每個泳道上樣量為50g)分離蛋白,用半干式轉膜儀將SDS-PAGE分離的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,用5%的脫脂奶粉常溫封閉1 h,然后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗PVDF膜3次,每次10 min;接著加入10L大豆14-3-3a蛋白兔抗體,與PVDF膜在常溫下孵育2～3 h;用PBS清洗PVDF膜3次后,加入偶聯有辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗,常溫孵育1 h;最后用高靈敏度化學發光檢測試劑盒顯示結果(羊抗兔二抗和高靈敏度化學發光檢測試劑盒均購于康為世紀生物科技有限公司)。

1.6煙草的處理和根相對生長量測定

鋁對植物的毒害作用最典型的癥狀表現在對根生長的抑制作用,因此通過測定根的生長量來分析煙草的鋁耐受能力。WT和轉基因煙草的組培苗水培2周,用pH 4.3的0.5 mmol/L CaCl2預處理過夜,記錄根的長度,然后置于0和50 μmol/L的AlCl3溶液(含有0.5 mmol/L CaCl2,pH 4.3)中處理24 h,記錄處理后的根長度,每個株系6個重復。根相對生長量/%=(處理后根長度-處理前根長度)/(對照處理后的根長度-對照處理前的根長度)×100。

1.7丙二醛和H2O2含量的測定

收集鋁脅迫處理后煙草根組織,在液氮中磨碎后用Tirs-HCl(1 mol/L,pH 7.5)抽提,離心收集上清液。丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的測定參考Gurel等[12]的方法;H2O2含量的測定參考Gay等[13]的方法。

1.8抗氧化酶活性的測定

凍存的根尖用液氮充分研磨后,用蛋白抽提緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4,甘油10%,巰基乙醇10 mmol/L,PMSF 1 mmol/L, EDTA 2 mmol/L,不溶性PVP 10%)提取可溶性蛋白,采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白的含量。過氧化物酶(peroxidase,POD)活性測定參照Britton等[14]的愈創木酚方法。過氧化氫酶(catalase,CAT)活性測定按照Abei[15]的方法進行。抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性的測定采用Nakano等[16]的方法。

1.9煙草植株在低酸性土壤中的生長情況分析

將生長狀況一致的WT和轉基因煙草幼苗移栽到裝有1 000 g(干質量)的酸性土壤(pH 4.8)中,每周澆水2次,在光照時間為12 h、光照強度約為1 200mol/(m2·s)的溫室中培養3個月后觀察生長狀況并拍照。

1.10數據分析

所有的生理生化指標分析均進行3次重復。用ANOVA SPSS 17.0軟件進行統計學和差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1SGF14a過量表達產生的轉基因煙草株系

M:DNA分子標志物;NC:負對照(PCR體系中用去離子水進行PCR擴增);PC:正對照(以pK-35S-SGF14a質粒作為PCR模板);WT:野生型煙草;(S4、S9、S11、S12、S13、S19、S23):獲得的不同轉基因煙草株系編號;18S rRNA:內參基因. 　　M: DNA marker; NC: Negative control (with deionized water as template for PCR ); PC: Positive control (with pK-35S-SGF14a as template for PCR); WT: Wild type tobacco plants; (S4， S9， S11， S12， S13， S19, S23): Serial numbers of transgenic tobacco plants; 18S rRNA: Internal reference gene. 圖2　轉基因煙草基因組PCR(A)、RT-PCR(B)和蛋白質印跡法(C)檢測SGF14a基因的插入情況和轉錄水平 Fig.2　Genomic PCR (A), RT-PCR (B) and Western blot (C) analysis for detection of SGF14a integration and transcriptional levels in transgenic and wild type tobacco lines

利用大豆SGF14a的編碼區構建植物表達載體pK-35S-SGF14a(圖1),用pK-35S-SGF14a轉化煙草獲得具有Km抗性的轉基因株系23個,以基因組DNA為模板,用SGF14a基因的特異性引物進行基因組PCR擴增，檢測SGF14a基因在轉基因煙草中的插入情況(圖2A)。結果表明，在7個(S4、S9、S11、S12、S13、S19和S23)具有Km抗性的轉基因煙草株系中能夠擴增出與正對照相同的DNA片段(0.8 ku),而在負對照和WT中不能擴增出與正對照相同的DNA片段,說明在這7個轉基因株系的基因組中有SGF14a基因插入。RT-PCR分析結果(圖2B)表明，在WT中不能擴增出0.8 ku的SGF14acDNA片段,而在6個轉基因株系中除S9株系外都擴增出0.8 ku的SGF14acDNA,說明在這5個轉基因植株(S4、S11、S13、S19和S23)中SGF14a能夠正常轉錄。選擇3個(S11、S19和S23)轉基因株系提取根的可溶性蛋白進行蛋白印跡法分析(Western blot)(圖2C),結果在WT煙草中也檢測出14-3-3蛋白的條帶。這可能是因為WT煙草中本身的14-3-3蛋白與大豆14-3-3蛋白的同源性非常高,所以大豆14-3-3蛋白的抗體也能識別煙草的14-3-3蛋白所致。3個轉基因株系14-3-3蛋白的表達量明顯比WT煙草高,其中S11的表達量最高,S19和S23的表達量次之,說明在這3個轉基因株系中有SGF14a的過量表達。

2.2過量表達SGF14a對轉基因煙草鋁耐受性的影響

為了考察轉基因煙草對鋁脅迫的耐受性,用50 μmol/L AlCl3處理S11、S19、S23轉基因株系和WT無菌苗的根24 h后分析煙草根相對生長量(圖3A),結果顯示3個轉基因煙草根相對生長量比WT的高30%～40%,說明SGF14a基因的過量表達能夠增加煙草對鋁脅迫的耐受性。可溶性蛋白的含量能夠反映植物耐受環境非生物脅迫的程度,植物中可溶性蛋白含量越高,說明其耐受脅迫能力越強。從圖3B可以看出：在沒有鋁脅迫的正常生長條件下,3個轉基因煙草根中可溶性蛋白含量都比WT高,這說明過量表達SGF14a能夠增加煙草根中可溶性蛋白的積累；在50 μmol/L鋁脅迫24 h后,WT煙草和3個轉基因煙草根中可溶性蛋白含量都下降,但3個轉基因煙草根中可溶性蛋白含量仍然顯著高于WT,說明在煙草中過量表達SGF14a能夠增加可溶性蛋白的積累。

MDA含量反映了植物受脅迫后質膜的氧化程度,H2O2含量反映了脅迫后細胞內活性氧的積累。從圖3D可以看出：在沒有鋁脅迫的正常生長條件下,WT煙草和3個轉基因煙草根中MDA含量沒有明顯差別；50 μmol/L鋁脅迫24 h使WT煙草和轉基因煙草根中MDA含量上升,但3個轉基因煙草根中MDA含量仍然低于WT煙草。從圖3C可以看出：在正常生長條件下，轉基因煙草根中H2O2的含量明顯低于WT煙草,在鋁脅迫后WT煙草和轉基因煙草根中H2O2的積累都有所增加,但轉基因煙草根中H2O2含量明顯低于WT煙草。這說明在煙草中過量表達SGF14a可顯著降低煙草根中H2O2的含量,減輕在鋁脅迫下煙草根中H2O2的積累和膜脂肪過氧化程度。

-Al:無鋁處理組;+Al:50 μmol/L鋁處理組。柱狀圖上不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統計學意義. 　　-Al: Without Al treatment; +Al: 50 μmol/L Al treatment. Different lowercase letters above bar graph indicate statistically significant differences at the 0.05 probability level． 圖3　鋁脅迫下WT和轉基因煙草根中根相對生長量、可溶性蛋白、H 2O 2和MDA含量 Fig.3　Relative root growth and the contents of soluble protein, H 2O 2 and MDA in WT and transgenic tobacco lines under Al stress

-Al:無鋁處理組;+Al:50 μmol/L鋁處理組。柱狀圖上不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統計學意義. 　　-Al:Without Al treatment; +Al: 50 μmol/L Al treatment. Different lowercase letters above bar graph indicate statistically significant differences at the 0.05 probability level． 圖4　鋁脅迫下WT和轉基因煙草根中POD、CAT和APX活性 Fig.4　Activity of POD, CAT and APX in WT and transgenic tobacco lines under Al stress

2.3過量表達SGF14a對轉基因煙草抗氧化酶活性的影響

14-3-3蛋白對抗氧化酶活性的調控作用已經在研究中得到證實[17],POD、CAT和APX是清除活性氧最重要的抗氧化物酶類,在植物抗氧化系統中發揮著重要作用。為考察過量表達SGF14a在鋁脅迫下轉基因煙草抗氧化酶活性的影響,測定了50 μmol/L鋁脅迫24 h后轉基因和WT煙草根中POD(圖4A)、CAT(圖4B)、APX(圖4C)的活性。結果表明，在沒有鋁脅迫條件下,SGF14a過表達植株S11、S19、S23根中POD、CAT、APX活性均高于WT。鋁脅迫導致WT和3個轉基因株系根中POD、CAT、APX活性都升高,但3個轉基因株系中這3種抗氧化酶活性都顯著高于WT,這說明過量表達SGF14a能顯著增加轉基因煙草在鋁脅迫下根中抗氧化酶的活性。

2.4過量表達SGF14a對煙草適應酸性土壤能力的影響

鋁毒是酸性土壤中植物生長的重要限制因素,將S11、S19、S23轉基因株系和WT的無菌苗移栽到酸性土壤中栽培,觀察轉基因植物生長表型的變化,結果發現3個轉基因株系在酸性壤上的生長情況明顯優于WT(圖5)。在酸性土壤上生長的早期,3個轉基因煙草植株的高度比WT高20%(圖5A),在接近開花期,3個轉基因煙草植株的高度比WT高25%～30%(圖5B),說明在煙草中過量表達SGF14a可增加轉基因煙草適應酸性土壤生長的能力。

圖5　WT煙草和轉基因煙草在酸性土壤中生長30 d(A)和90 d(B)的狀況 Fig.5　Growth performance of WT and transgenic tobacco lines after 30 days (A) and 90 days (B) in the acidic soil

3討論

以往的研究[7]表明大麥葉片14-3-3蛋白結合蛋白中有谷胱甘肽還原酶、抗氧化酶Mg-SOD、POD、APX等。在高等植物中,14-3-3蛋白與抗氧化酶APX的互作在植物應答鹽脅迫過程中發揮重要作用,如在擬南芥中過量表達番茄的14-3-3蛋白TFT7可提高轉基因植物APX的活性,在鹽脅迫下轉基因植物H2O2和MDA的含量顯著低于WT,轉基因植物抗鹽能力顯著增強[18]。在轉基因水稻中通過RNAi干擾技術沉默14-3-3基因GF14e的表達,使抗氧化酶基因POX22.3的表達增強,過氧化物酶相關防御反應被激活,細胞壁物質的交聯作用增強,限制病原體侵染,因而提高水稻對白葉枯病菌的抗性[19],這說明14-3-3蛋白對抗氧化酶的表達和活性有調控作用。植物體內H2O2含量的變化與抗氧化酶的表達水平或活性及抗氧化物質的含量有關,本研究在轉基因煙草中過量表達RB的14-3-3蛋白使鋁脅迫下轉基因煙草根中3種清除H2O2的抗氧化酶活性顯著高于WT,因此H2O2和MDA含量顯著低于WT。這說明在轉基因煙草根中過量表達RB的SGF14a可通過調控抗氧化酶的活性來降低根中H2O2的含量,由此提高煙草抗鋁脅迫的能力。

本研究還觀察到過量表達SGF14a可影響轉基因煙草根中可溶性蛋白的含量。在無鋁脅迫下,過量表達大豆SGF14a的轉基因煙草根中積累的可溶性蛋白顯著高于WT。Schoonheim等[7]的研究表明在大麥葉片14-3-3蛋白的結合蛋白中有核糖體結合蛋白、蛋白質翻譯的起始因子6和延伸因子1a等,說明14-3-3蛋白參與了蛋白質合成的調控。可溶性蛋白的含量和植物的耐鋁能力有關,有些耐鋁植物在鋁脅迫下通過增加可溶性蛋白的合成來緩解鋁的毒性。過量表達14-3-3蛋白的轉基因煙草在鋁脅迫下根內積累的可溶性蛋白顯著高于WT,這可能是轉基因煙草耐鋁能力增強的另一原因之一。

參考文獻(References)：

[1]Sehnke P C, DeLille J M, Ferl R J. Consummating signal transduction the role of 14-3-3 proteins in the completion of signal-induced transitions in protein activity.ThePlantCell, 2002,14:339-354.

[2]Comparot S, Lingiah G, Martin T.Function and specificity of 14-3-3 proteins in the regulation of carbohydrate and nitrogen metabolism.JournalofExperimentalBotany, 2003,54(382):595-604.

[3]Janicka-Russak M,Klobus G. Modification of plasma membrane and vacuolar H+-ATPase in response to NaCl and ABA.JournalofPlantPhysiology, 2007,164:295-302.

[5]Campo S, Peris-Peris C, Montesinos L,etal. Expression of the maizeZmGF14-6 gene in rice confers tolerance to drought stress while enhancing susceptibility to pathogen infection.JournalofExperimentalBotany, 2012,63(2):983-999.

[6]Yan J Q, He C X, Wang J,etal. Overexpression of theArabidopsis14-3-3 protein GF14λ in cotton leads to a “stay-green” phenotype and improves stress tolerance under moderate drought conditions.PlantandCellPhysiology, 2004,45(8):1007-1014.

[7]Schoonheim P J, Veiga H, da Costa Pereira D,etal. A comprehensive analysis of the 14-3-3 interactome in barley leaves using a complementary proteomics and two-hybrid approach.PlantPhysiology, 2007,143(2):670-683.

[8]Ma J F, Furukawa J. Recent progress in the research of external Al detoxification in higher plants: A minireview.JournalofInorganicBiochemistry, 2003,97(1):46-51.

[9]Tomasi N, Kretzschmar T, Espen L,etal. Plasma membrane H+-ATPase-dependent citrate exudation from cluster roots of phosphate-deficient white lupin.Plant,Cell&Environment, 2009,32(5):465-475.

[10]Chen Q, Guo C L, Wang P,etal. Up-regulation and interaction of the plasma membrane H+-ATPase and the 14-3-3 protein are involved in the regulation of citrate exudation from the broad bean (ViciafabaL.) under Al stress.PlantPhysiologyandBiochemistry, 2013,70:504-511.

[11]Guo C L, Chen Q, Zhao X L,etal. Al-enhanced expression and interaction of 14-3-3 protein and plasma membrane H+-ATPase is related to Al-induced citrate secretion in an Al-resistant black soybean.PlantMolecularBiologyReporter, 2013,31(4):1012-1024.

[12]Gurel A, Coskun O, Armutcu F,etal. Vitamin E against oxidative damage caused by formaldehyde in frontal cortex and hippocampus: Biochemical and histological studies.JournalofChemicalNeuroanatomy, 2005,29(3):173-178.

[13]Gay C A, Gebicki J M. Measurement of protein and lipid hydroperoxides in biological systems by the ferric-xylenol orange method.AnalyticalBiochemistry, 2003,315(1):29-35.

[14]Britton C, Maehly A C. Assay of catalase and peroxidase.MethodsinEnzymology, 1955,59(2):764-775.

[15]Abei H.Catalaseinvitro.MethodsinEnzymology, 1984,105:121-126.

[16]Nakano Y, Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts.PlantandCellPhysiology,1981,22(5):867-880.

[17]Lukaszewicz M, Matysiak-Kata I, Aksamit A,etal. 14-3-3 protein regulation of the antioxidant capacity of transgenic potato tubers.PlantScience, 2002,163:125-130.

[18]Xu W F, Shi W M. Mechanisms of salt tolerance in transgenicArabidopsisthalianaconstitutively overexpressing the tomato 14-3-3 protein TFT7.PlantandSoil, 2007,301(1/2):17-28.

[19]Manosalva P M, Bruce M, Leach J E. Rice 14-3-3 protein (GF14e) negatively affects cell death and disease resistance.ThePlantJournal, 2011,68(5):777-787.

*通信作者(Corresponding author):陳麗梅,Tel:+86-871-65920213;E-mail:chenlimeikm@126.com

第一作者聯系方式:韓雙,E-mail:sshuanghan@163.com

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.s.20150519.1316.007.html