響應面分析法優(yōu)化復方益母草口服液提取工藝研究

響應面分析法優(yōu)化復方益母草口服液提取工藝研究

河北省唐山市婦幼保健院曹冬梅張偉杜國輝姜海英謝巍(唐山 063000)

提要目的：優(yōu)化復方益母草口服液提取工藝。方法：通過響應面分析法考察溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間對鹽酸水蘇堿的含量和浸膏得率的影響。結果：溶劑用量、提取時間、提取次數(shù)3個因素對綜合評分指標具有顯著性影響，結合單因素實驗結果和生產(chǎn)實際，復方益母草口服液最佳提取工藝為加水倍數(shù)9倍，提取時間100 min，提取次數(shù)3 次。 結論：通過響應面分析建立的模型能很好地預測復方益母草口服液的提取效果，且建立的工藝穩(wěn)定可行，可為復方益母草口服液工藝改進提供參考。

關鍵詞復方益母草口服液；益母草；雞血藤；響應面分析法；優(yōu)化；提取工藝；綜合評分法

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：碼：A

文章編號：號：1007-5615(2015)03-0044-04

復方益母草口服液為我院自制制劑，由益母草和雞血藤兩味中藥組成，具有清熱涼血，活血調(diào)經(jīng)的功效，主治熱結血瘀所致的月經(jīng)過多，產(chǎn)后子宮出血，子宮復原不全，臨床使用十余年療效好且無明顯不良反應。傳統(tǒng)一直依據(jù)經(jīng)驗采取煎煮法提取，為確定復方益母草口服液的最佳提取工藝，本實驗采用響應面分析法[1-3]進行系統(tǒng)性研究。

1試藥與儀器

島津2501型紫外分光光度計，BP-211D型分析天平；益母草(批號：15012404)、雞血藤(批號：14111501)藥材飲片購自石家莊市柏林藥材加工廠，藥材質(zhì)量符合《中國藥典》2010版一部要求；鹽酸水蘇堿對照品(批號：110712-201209)由中國藥品生物制品檢定所提供；硫氰酸鉻銨由國藥集團化學試劑有限公司提供；提取用水為飲用水，其它試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1鹽酸水蘇堿的測定

2.1.1測定方法：按照河北省醫(yī)療機構制劑質(zhì)量標準JZBZ20090976-2012，采用紫外分光光度法測定鹽酸水蘇堿的含量，分別測定對照品、供試品和空白試劑溶液在520 nm處吸光度(0.1 mol/L鹽酸溶液為空白對照)，計算時用空白試劑的吸光度減去對照品或供試品溶液的吸光度。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1樣品提取液的制備：按處方比例(益母草︰雞血藤=2︰1)分別稱取益母草50 g，雞血藤25 g，按實驗設計的溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間進行提取，過濾后濃縮至100 mL，備用。

2.1.2.2供試品溶液制備：精密量2.1.2.1項下樣品溶液10 mL，以0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，加活性炭0.5 g，置沸水浴中加熱0.5 min，濾液精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻；冰水浴1 h，濾過取續(xù)濾液測定吸光度。

2.1.2.3空白試劑溶液制備：精密量取0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻；冰水浴1 h，濾過取續(xù)濾液測定吸光度。

2.1.2.4對照品溶液制備：精密稱取鹽酸水蘇堿對照品(使用前105℃干燥至恒重)25 mg，置25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液(每1 mL含鹽酸水蘇堿1 mg)。精密量取上述對照品儲備溶液2.0、4.0、6.0、8.0 mL，以0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，加活性炭0.5 g，置沸水浴中加熱0.5 min，濾液精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至25 mL，搖勻；冰水浴1 h，濾過取續(xù)濾液測定吸光度。

2.1.3標準曲線繪制以吸光度的差值(△A，空白試劑的吸光度分別減去對照品的吸光度)為縱坐標、鹽酸水蘇堿濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到鹽酸水蘇堿的含量回歸方程為：Y1=6.3705×△A+0.154

2.2提取液浸膏得率的測定[2]精密量取2.1.2.1項下樣品溶液20 mL，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，105℃干燥至恒重，計算，即得。

2.3綜合評分方法[4-5]綜合考慮鹽酸水蘇堿的質(zhì)量濃度 ( Y1︰mg /mL) 與浸膏得率 ( Y2︰g /mL)，上述兩項分別乘以不同權重系數(shù)0.7和0.3再相加即為綜合得分(Y =0.7Y1+0.3Y2)作為提取率的考察指標。

2.4提取工藝單因素試驗

2.4.1溶劑用量:設定每次提取時間為60 min，提取次數(shù)為3次，改變加水量為藥材質(zhì)量的6倍、8倍、10倍、12倍，按供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，考察溶劑用量對提取綜合得分的影響，綜合評分結果分別為 0.697、0.860、0.867、0.883，結果顯示加水量對綜合評分影響不大，但由于益母草和雞血藤屬草質(zhì)藥材，吸水量大，6倍水不足以使藥材充分浸泡，故選擇加水量為藥材質(zhì)量的8倍。

2.4.2提取次數(shù)：設定加水量為藥材質(zhì)量的8倍，提取時間60 min，改變提取次數(shù)為 1、2、3、4、5 次，按供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，考察提取次數(shù)對提取綜合得分的影響，綜合評分結果分別為 0.373、0.537、0.825、0.865、0.869。表明隨著提取次數(shù)的增加綜合評分稱上升趨勢，但提取3次以上時，綜合得分提高很少，因此提取次數(shù)定為3次。

2.4.3提取時間：設定加水量為藥材質(zhì)量的 8 倍，提取次數(shù)為3次，改變提取時間為 30、60、90、120、180 min，按供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，考察提取時間對提取綜合得分的影響，綜合評分結果分別為 0.395、0.853、1.035、1.044、1.026，結果提取時間為 90 min 基本提取完全， 90 min 之后綜合得分隨著時間的加長增高不明顯，提取180 min時甚至有略微下降。因此確定提取時間為90 min。

2.5提取工藝優(yōu)化試驗

2.5.1響應面試驗及響應值結果：在單因素試驗結果的基礎上，確定響應面分析法試驗設計的因素為溶劑用量(A)、提取次數(shù)(B)、提取時間(C)，因素水平單位因素實驗中選取的最優(yōu)取值點及其上下區(qū)域各1個點，見表1。根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，以綜合得分為考察指標，采用Design-Expert8.0統(tǒng)計軟件設計三因素三水平17個試驗點的響應面分析，設計方案及綜合得分的響應值見表2。

表1 復方益母草口服液提取工藝響應面分析因素水平

編碼水平溶劑用量(A)提取次數(shù)(B)提取時間(C)-16260083901104120

表2復方益母草口服液提取工藝試驗設計及響應值

編號ABCY163600.7002631200.849364900.919483901.0355102900.814683901.03871031201.035883901.037962900.7021084600.88411841201.0471283901.0371382600.54014104901.0371583901.03716821200.91617103600.867

2.5.2模型擬合及預測：通過Design-Expert 8.0軟件對響應值與各因素編碼值進行回歸擬合，得到回歸方程如下: Y =-3.256+0.333×A+0.823×B+0.028×C+7.500×10-4AB+7.917×10-5×A×C- 1.775×10-3×B×C-0.0191×A2-0.092 ×B2-1.085×10-4×C2。模型方差分析結果見表3，見回歸模型極其顯著(<0.000 1)，另外在置信區(qū)間95%時，因變量和全體自變量之間的線性關系顯著 ( R = 0. 978)，說明建立的模型有意義；失擬項較小，說明模型擬合度良好，可以用方程計算數(shù)據(jù)對實驗結果進行分析和預測；模型的確定系數(shù)R2Adj為0.949，說明響應值的變化有94.9%來源于所選自變量，即溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間，模型方程各自變量方差分析表明，對提取響應值影響最大的是方程一次項 A(溶劑用量) 、B(提取次數(shù))和C(提取時間)，其中B和C影響最大，方程二次項A2、B2、C2對提取響應值也具有顯著性影響，但與一次項比較稍差，而交互項AB、AC對提取響應值的影響不明顯，印證了復方益母草口服液工藝優(yōu)化模型中各因素并不是簡單的線性關系。

2.5.3響應曲面分析與優(yōu)化：根據(jù)回歸方程可繪制三維空間響應曲面圖，因其只能同時反應2個自變量及其交互作用對綜合得分的影響，[6]需固定溶劑用量、提取次數(shù)和提取時間其中1個因素。詳見圖1~圖3。

表3　復方益母草口服液提取工藝回歸模型與方差分析

圖1　提取次數(shù)和溶劑用量對綜合評分的影響

圖2　提取時間和溶劑用量對綜合評分的影響

圖3 提取時間和提取次數(shù)對綜合評分的影響

由響應曲面圖可知，隨著提取次數(shù)的增加，綜合評分值也隨之增加，但當提取次數(shù)增大到一定程度后，綜合評分值有下降的趨勢；隨著提取時間的增加，綜合評分值也隨之增加，但是當提取時間增加到一定比例后綜合評分不再增加反而下降；溶劑用量對綜合評分值影響趨勢較上述兩者不明顯，這點由響應曲面的陡峭程度也明顯可見，這與方差分析結果一致。

利用Design-Expert 8. 0統(tǒng)計軟件求解回歸方程得到，以綜合評分為指標，復方益母草口服液的最佳提取工藝：溶劑用量為8.99倍水，提取次數(shù)3.501次，提取時間103.2 min，此時復方益母草口服液提取響應值最高為1.106。考慮到生產(chǎn)簡便易行和資源節(jié)約的原則，確定最佳提取工藝為加水倍數(shù)9倍，提取次數(shù)3次，提取時間100 min。

2.5.4 驗證試驗：按照篩選的優(yōu)化提取工藝制備樣品溶液3批，以鹽酸水蘇堿含量和浸膏得率計算綜合得分，復方益母草口服液提取響應值為1.097(RSD=0.38%)，與理論預測值接近，該工藝穩(wěn)定、提取率理想。

3討論

優(yōu)化提取工藝的方法很多，常用的有單因素實驗、正交設計實驗、均勻設計實驗、析因設計實驗等，而響應面分析法通過連續(xù)的實驗方法，建立實證模型，其得到的回歸方程精度高，并不是一種點對點單一的優(yōu)化方法，能夠?qū)?yōu)化過程延伸到面的程度，呈現(xiàn)立體效果，具有突出的優(yōu)越性，越來越廣泛的應用于化學、醫(yī)藥、食品的多個領域。[7-8]

復方益母草口服液是由兩

本實驗通過單因素與響應面結合的方法進行實驗，簡單易行，預測性良好，確定了最佳提取工藝，為工藝改進提供理論基礎。

參考文獻

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(2015-07-23收稿)