葡萄酒色斑中GNAQ基因突變的研究進展

朱佳芳　于文心　馬剛　林曉曦

葡萄酒色斑中GNAQ基因突變的研究進展

朱佳芳于文心馬剛林曉曦

【提要】鳥嘌呤核苷酸結合蛋白q多肽（G uanine nucleotide binding protein q polypeptide，GNAQ）是GTP結合蛋白異源三聚體的組成部分，能夠通過結合細胞表面受體介導下游信號通路。最近的研究發現，葡萄酒色斑（P ort-wine stains，PWS）中GNAQ p.Arg183點突變，可能介導細胞外信號調節激酶（E xtracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路。本文對GNAQ基因突變可能介導的下游信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、G蛋白信號調節因子5（regulator of G protein signaling 5，RGS5）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和YAP等信號通路進行綜述。

葡萄酒色斑鳥嘌呤核苷酸結合蛋白q多肽絲裂原活化蛋白激酶G蛋白信號調節因子5蛋白激酶C

葡萄酒色斑（Port-wine stains，PWS）是先天性毛細血管畸形，發病率約為0.3%。Sturge-Weber綜合征是以三叉神經眼支支配區域、軟腦膜和脈絡膜毛細血管靜脈畸形為主要特征的綜合征，主要表現為V1/V2區PWS、青光眼、癲癇、休克及智力發育遲緩等[1]。Shirley等證實了PWS中存在體細胞突變，發現了GNAQ p.Arg183Gln點突變[2-3]，以及該位點其他突變類型[4-5]，和該突變分布的組織類型[6]。但該突變所參與的信號通路至少有部分與腫瘤中GNAQ常見的突變p.Gln209Leu存在差異[2]，可能是其導致血管壁不正常擴張而非惡性腫瘤的原因所在。

1　GNAQ基因及其蛋白質

1.1GNAQ基因

編碼人鳥嘌呤核苷酸結合蛋白q多肽（GNAQ）的基因位于9q21.2，跨越310 993核苷酸序列，包含7個外顯子區域，轉錄長度為6 539堿基對（Base pair，bp），開放讀碼框（Open reading frame，ORF）長度為1 080 bp[7]。

1.2GNAQ蛋白結構

G蛋白根據其α亞單位分成4個家族，包括Gi、Gs、G12/ 13和Gq。Gq家族包含4個成員：Gq、G11、G14和G15/16。其相應的α亞單位為Gαq、Gα11、Gα14、Gα15/16[8]。GNAQ編碼Gαq蛋白由359個氨基酸組成，包含兩個結構域，一個Ras樣三磷酸鳥苷酶結合結構域（Ras-like GTPase binding domain）以及一個α螺旋結構域（αhelical domain）。這兩個結構域之間形成一個口袋結構能夠結合二磷酸鳥苷（G uanosine diphosphate，GDP）。在GTPase結構域中有3個活動結構域稱之為開關（Switch），包括SwitchⅠ、SwitchⅡ、SwitchⅢ，該結構域氨基酸殘基結合GTP后能發生構像改變[9]

1.3Gαq蛋白功能

G蛋白偶聯受體（G protein coupled receptors，GPCRs)是由7個α螺旋組成的跨膜蛋白，是一類細胞表面的受體家族[10]。GPCRs主要通過與G蛋白結合激活下游信號通路。當細胞外配體與GPCRs相結合后，其構像發生改變，形成一個結合袋，與胞質內的G蛋白異源三聚體Gαβγ結合，GPCR能起到鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factor，GEF）的作用，催化α亞單位釋放GDP并與胞質內高濃度的GTP結合，在活化狀態下，Gα亞單位與G-βγ亞單位分離，switchⅠ～Ⅲ發生構像改變[11]。結合GTP的Gα亞單位或G-βγ亞單位，能通過活化二級信使，如腺苷酸環化酶（A denylyl cyclase）、磷脂酶C（P hospholipase C，PLC），激活下游信號通路[12]。G蛋白信號調節因子（G-protein signaling，RGS）家族能夠加速GTPase的作用，使GTP水解為GDP，此時的Gαq轉變為非活化狀態，再次以G蛋白異源三聚體的形式存在于胞內，停止激活下游信號通路。

2　PWS中GNAQ基因突變

2.1GNAQ（c.548G＞A,p.Arg183Gln）點突變

Shirley等報道了Sturge-Weber綜合征患者以及PWS患者中GNAQ 4號外顯子單核苷酸突變（c.548G＞A,p. Arg183Gln）。該報道對Sturge-Weber綜合征患者組織活檢并進行全基因組測序，發現了GNAQ（c.548G＞A,p.Arg183Gln）點突變。該研究組進一步對Sturge-Weber綜合征的患者以及無癥狀的PWS患者取樣測序，發現Sturge-Weber綜合征的患者GNAQ總突變率在88%（23/26），無癥狀PWS患者突變率在92%（12/13），標本中等位基因突變頻率為1.0%～18.1%。但并未發現熱點突變，如GNA11、GNAQ p.Gln209等的突變[2]。

2.2GNAQ（c.547C＞G,p.Arg183Gly）點突變

Frigerio等在證實原有突變位點的基礎上，首次在PWS皮膚組織中發現1例新的GNAQ（c.547C＞G,p.Arg183Gly）點突變，組織中突變頻率為4%[4]。

2.3組織分布

Tan等利用激光顯微切割技術（L aser capturem icroscopy，LCM）從10例PWS皮膚病灶中分離出血管、表皮、毛囊和結締組織，利用巢式PCR（Nesting PCR）技術分析了GNAQ（c. 548G→A,p.Arg183Gln）點突變在組織中的分布，證實了該突變60%（6/10）分布在血管，突變率為3.16%～12.37%。這6例中，20%（2/10）分布在結締組織，突變率分別為22.17%和6.43%。另外4例血管內未發現突變，但其中2例結締組織和（或）毛囊/腺體內發現GNAQ突變，突變頻率為2.67%～6.62%[6]。Uchiyama等利用肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）以及數字微滴多聚酶鏈（Droplet digital PCR，ddPCR）反應技術，提升了組織中GNAQ突變的檢測極限，達到0.1%（3個拷貝數），并首次在10%（4/40）的Sturge-Weber綜合征患者血液白細胞和唾液中發現了GNAQ突變[13]。

2016年，Salato等利用ddPCR技術發現18例散發PWS患者組織內100%（18/18）存在GNAQ（c.548G→A,p. Arg183Gln）點突變，而Sturge-Weber綜合征患者100%（4/4）皮膚組織及60%（3/5）腦組織中存在該突變。該突變可能成為鑒別PWS與其他脈管畸形的重要依據之一。

3　突變可能介導的相關信號通路

3.1MAPK信號通路

活化狀態下的Gαq通過激活PLCβ，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（Phophotidy linositol diphosphate PIP2）水解成肌醇三磷酸（Inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）[14]。IP3和DAG進一步通過二級信使如鈣離子和蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）傳導信號通路。PKC能夠通過磷酸化Raf/MEK1/2/ERK信號通路，從而激活MAPK信號通路[15]。Shirley等[2]發現，GNAQ p.Arg183Gln點突變能使ERK表達量顯著增加，但不能使p38和c-Jun氨基端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）過表達，推測GNAQ p.Arg183Gln點突變是通過ERK途徑過度激活MAPK信號通路。Shirazi檢測到MAPK下游信號通路磷酸化核糖體蛋白S6（Phosphorylated ribosomal protein S6，RPS6），存在于Sturge-Weber綜合征患者PWS組織的畸形血管壁內，推測RPS6可能是PWS中MAPK的下游潛在靶點之一[16]。

3.2RGS5信號通路

RGS能夠調節Gα蛋白GTPase的作用，抑制下游信號通路。RGS5是RGS家族成員之一，主要在血管平滑肌細胞（V ascular smooth muscle cells，VSMC）以及周細胞（P ericytes）中表達，潛在的作用靶點為Gi和Gq。Cho等發現敲除Rsg5等位基因的小鼠主動脈擴張，血壓明顯降低，提示該RSG5可能是調節血管收縮的重要因子[17]。PWS組織內主要病理特征為毛細血管及微靜脈擴張畸形，猜測GNAQ突變后，其GTPase結構域可能失去RGS5調控作用而最終導致微血管不正常擴張。

3.3PKC信號通路

PKC蛋白家族至少由7個密切相關的蛋白質組成，被劃分為經典型（α，β，γ），新型（δ，ε，η，θ）以及非典型（ζ，λ/ι）等3種同源異構體（I soform）。Wu等[18]發現，enzastaurin能夠選擇性抑制經典型（β，γ）以及新型（δ，ε，θ）同源異構體，將GNAQ突變細胞系抑制在G1期，并增加細胞凋亡。該機制可能是通過減少ERK磷酸化和細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表達從而減少MAPK信號通路激活實現。Sotrastaurin為PKC更強的抑制劑，進一步證實了ERK在PKC信號通路中的作用[19]，同時，也發現其減少了核轉錄因子-kB（N uclear transcription factor-kB，NF-kB）信號通路的表達。因此，PKC/NF-kB可能是獨立于MAPK的另一條信號通路[20]。

3.4YAP以及下游信號通路

Hippo信號通路參與器官大小的形成，該通路異常會導致惡性腫瘤的發生。Hippo信號通路中，MST1/2以及Lats1/2激酶能夠使YAP磷酸化，使其在胞質中處于失活狀態。YAP/ TAZ去磷酸化能夠激活轉錄因子TEAD和SMAD家族，使細胞增生[21]。細胞轉導了GNAQ基因突變后，使得YAP/TAZ去磷酸化并激活。Feng等[22]發現，突變的GNAQ蛋白是通過GEF Trio以及下游的GTPase Rho/Rac調節YAP信號通路。Rho/Rac能夠聚合肌動蛋白并游離血管抑素結合蛋白（A ngiomotin），增加YAP進入核內的能力，從而導致核內轉錄水平增加。

4　展望

GNAQ中的GTP結合袋（Guanosine triphosphate binding pocket，GTP）結構域183位點精氨酸殘基在所有人Gα亞單位中保守，是GTPase的關鍵位點。該位點精氨酸殘基被谷氨酸殘基所取代，可能會使下游信號通路異常激活[23]。GNAQ p. Arg183Gln點突變能使ERK表達量顯著增加，但不使p38和JNK過表達[2]。最近研究發現PWS患者組織中ERK和JNK表達量增加，提示PWS中可能存在其他突變介導該信號通路的發生[4]。利用新的PNA-ddPCR技術，能夠使GNAQ突變檢測極限達到0.1%（3拷貝數）[13]。近來，通過二代測序已經在PWS組織中發現了RASA1、SMARCA4、EPHA3、MYB、PDGFR-β和PIK3CA等新的突變[5]，但是GNAQ基因突變仍是組織中最精準可靠的突變位點，隨著檢測技術的更新及普及，未來該突變可能成為鑒別PWS與其他脈管畸形的重要依據之一。

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GNAQ M utations in P ort-W ine S tains

ZHU Jiafang,YUWenxin,MA Gang,LIN Xiaoxi.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LIN Xiaoxi(E-mail:linxiaoxi@126.com).

【Summary】G-alpha-q(GNAQ)is the alpha subunit of the heterotrimeric GTP-binding proteins that mediates the regulators of several downstream signaling through coupling cell surface receptors.Recently,lesionswithin port-wine stains are found harbormutations in GNAQ p.Arg183 and may at least associate with ERK(extracellular signal-regulated kinase) signaling pathways.In this paper,themutations of GNAQ within port-wine stains and themultiple activated signaling targets downstream ofmutant GNAQ,including MAPK,RGS5,PKC and YAP pathwayswere reviewed.

Port-wine stains;Guanine nucleotide binding protein q polypeptide;Mitogen-activated protein kinase; Regulator of G protein signaling 5;Protein kinase C

R732.2

B

1673－0364（2016）05－0322－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.014

國家自然科學基金面上項目（81272127）；上海市衛生系統重要疾病聯合攻關重點項目（2013ZYJB0014）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

林曉曦（E-mail：linxiaoxi@126.com）。

（2016年3月9日；

2016年3月30日）