核桃優良無性系組培初代培養條件探索

羅在柒﹡，顏鳳霞，田 凡

（貴州省林業科學研究院，貴州 貴陽 550005）

核桃優良無性系組培初代培養條件探索

羅在柒﹡，顏鳳霞，田 凡

（貴州省林業科學研究院，貴州 貴陽 550005）

主要對核桃優良無性系初代培養外植體材料選擇、消毒方法和培養條件進行探索，結果表明，核桃組培最佳外植體采集為3—6月份的莖尖，消毒方法應盡可能簡便、快速，培養條件需經過低溫暗培養，試驗結果可為核桃良種組培開繁提供借鑒。

核桃；組織培養；外植體選擇；消毒方法；培養條件

植物組培技術是工廠化生產中廣泛應用的現代生物技術，也是快速繁殖植物新品種最主要的方法。迄今為止，植物組培技術在植物離體快繁、無病毒苗木培育、遺傳育種及種質資源保存等方面都取得了顯著成績。GaleMcGranahan等報道，核桃成年品種離體繁殖已獲成功，并已進行生產試驗[1]。樊靖等報道了以5個核桃品種 (株系)10年生植株的莖段為外植體進行的離體培養和植株再生研究[2]。在核桃種胚的離體培養方面國內外學者也做了大量研究。優良無性系核桃組培由于樹體本身富含多酚物質，易發生褐化，初代培養難度大。本文主要進行核桃優良無性系初代培養外植體材料選擇、消毒方法和培養條件的探索，以期對核桃無性系組培提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃優良無性系為黔林核1號（Juglans sigillata“qianlinhe-1”），1973年在牛棚初選，入選省級優樹，1981—1990年進行無性系品比試驗，篩選為優樹，1985年命名為早熟露仁核桃，作為大面積推廣的主栽品種。材料來源于貴州省林科院采穗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇

通過采集越冬頂芽和腋芽、萌動期頂芽和腋芽、快速生長期（半木質化）頂芽和腋芽等材料，分不同批次消毒和接種，材料大小以莖段長度為計量標準，設置1～4cm，對比統計不同時期外植體材料以及材料的大小在核桃組培過程中褐化和生長情況。

1.2.2 消毒與抑制物質篩選

消毒分為常規處理和新型消毒劑“山農I號”作對比。常規處理用自來水沖洗材料30 min；用洗潔凈清洗材料，若大田材料污染較重，可以用軟毛刷輕輕刷洗莖段和葉片，然后用自來水沖洗干凈；用濾紙吸干其表面水分；置于2%硫代硫酸鈉溶液中浸泡20～30min；用蒸餾水沖洗4～5次。山農I號，將外植體按要求枝剪后置于消毒液3min，直接接入培養基。抑制物質以活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮Polyvinyl pyrrolidone）等做對比試驗，即每升培養基中添加1.5g活性炭和3.0gPVP，能有效抑制外植體褐化。

1.2.3 外植體培養

通過對照低溫暗培養、常溫暗培養和正常培養條件。正常培養條件白天溫度為25±3℃，夜間溫度為18±2℃，光照時間15h/d，光照強度2 000 lx，初代供試培養基均為改良DKW+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L。

2 結果與分析

2.1 外植體材料篩選，獲得脫毒有效外植體材料

不同時期采集外植體材料培養結果得到：越冬頂芽和腋芽雖然污染率高，但易于生長，黃化現象嚴重；萌動期頂芽和腋芽主要特點為褐化嚴重，外植體停止生長，其污染率低；快速生長期（半木質化）頂芽褐化相對嚴重，污染率相對高，腋芽能較好萌發，但脫離母體后停滯生長。

通過外植體材料生物量大小試驗結果得到，核桃組培必須盡量增大外植體生物量，即外植體材料控制在4.0 cm左右，才能保證緩解外植體褐化，獲得有效脫菌無性系材料。

核桃組培最佳外植體為3—6月份的莖段，且莖段的芽較粗壯，約為0.3～0.5 cm，莖部木質化程度不高的莖段萌芽率高。

2.2 外植體消毒方法的篩選

消毒方法的篩選主要是以控制外植體褐化，或者抑制啟動褐化物質產生為原則，盡可能使消毒時間短、步驟少。通過試驗得到應用過新型消毒劑，即“山農I號”消毒液能較好實現消毒效果，比常規試劑如氯化汞、酒精等消毒效果更好。

2.3 抑制外植體褐化物質的篩選

基本培養基篩選。通過試驗，在培養基中降低硝基鹽濃度，能緩解褐化發生，DKW培養基優于MS培養基。培養基中添加活性炭、PVP等物質能有效緩解外植體褐化，即每升培養基中添加1.5 g活性炭和3.0 gPVP能有效抑制外植體褐化。 增加繼代頻次能使培養基多酚物質與外植體分開，一定程度上減少對外植體的傷害。外植體接種后，3～5 d內每天更換一次培養基，可以得到理想的效果。

2.4 培養條件的篩選

外植體接種后置于4℃冰箱暗培養3 d后，再繼續置于組培室中培養，有益于防治褐化的發生。尤其注意在拿出冰箱后第二天開始出現輕度的褐化現象，接著第3、4天，褐化會加劇且污染莖段亦呈現，需及時處理。在第15天左右，會出現萌芽現象。萌芽后再轉接培養很容易污染、長霉菌，特別是在長葉后更容易長菌污染且容易出現黃化現象，所以每隔3～5 d需轉接一次。

3 結論

外植體應選擇在3—6月核桃快速生長季的莖段，外植體材料盡可能粗壯，長度在4 cm左右為宜；消毒方法盡可能快捷，避免對外植體傷害，接種后經4℃低溫暗培養3 d轉入正常培養。接種初期增加繼代次數更換培養基，有益于防治褐化的發生。

[1]McGranahanGH.etal.In vitro propagation of mature Persianwalnut cultivars[J].Hortsci. 1988,28(1):220.

[2]樊靖,劉慶忠,張俊林，等.核桃離體培養和

植株再生[J].2009,36(6):867-872.

1005-2690（2016）12-0104-02

S664.1

B

貴州省林業科研課題編號：黔林科合J字[2012]03號