Per家族基因在相關惡性腫瘤中的研究及進展*

王 睿綜述， 金 風審校

(1.貴州醫科大學， 貴陽 550004;.貴州醫科大學附屬醫院腫瘤科 貴州省腫瘤醫院頭頸腫瘤科， 貴陽 550004)

?綜述與講座?

Per家族基因在相關惡性腫瘤中的研究及進展*

王 睿1綜述， 金 風2△審校

(1.貴州醫科大學， 貴陽 550004;.貴州醫科大學附屬醫院腫瘤科 貴州省腫瘤醫院頭頸腫瘤科， 貴陽 550004)

近年來，時鐘基因(circadian clocks)與腫瘤發生及預后關系的研究已成為熱點，迄今的研究也證明時鐘基因的核心基因Per家族基因與腫瘤表達及預后之間有密切聯系。同時，根據生物節律變化而采用的時辰治療模式也在積極探索中且在臨床研究中取得了一定的結果。本文針對Per家族基因在相關惡性腫瘤中的研究及Per家族基因同時辰治療的聯系進行綜述。

Per家族基因； 腫瘤； 時辰治療

時鐘基因(circadian clocks)首次發現于甲蟲眼外光感受器形成及功能的研究中。目前研究發現的時鐘基因至少包括9種，即：Period-1(Per1)，Period-2(Per2)，Period-3(Per3)，circadian locomotor output cycle kaput(CLOCK)， Cryptochrome-1(CRY1)，Cryptochrome-2(CRY2)，the brain and muscle Arnt-like protein-1(BMAL1)，Casein kinase-1(CK1)和Timelss(TIM)。人類、動物及許多植物都擁有一個內在的調節生理行為和生化周期節奏的生物鐘，并使之與一天24小時的晝夜循環相一致。正常晝夜節律的改變促使了細胞的異常增殖，從而導致時鐘基因規律調節人體的各種生理過程發生改變，包括血壓、激素分泌、睡眠和免疫活動等。晝夜節律的紊亂可能會增加疾病發生的風險，如心血管疾病、免疫系統疾病和癌癥等。Per家族基因作為一個大團體，其成員Per1、Per2、Per3在時鐘基因調節體內生物鐘變化中起到了至關重要的作用。

目前興起的時辰治療模式是基于生物體內晝夜節律變化而采用的一種個體化治療模式，但是在關于時辰治療理論基礎研究中，鮮少與時鐘基因相關聯。

因此對時鐘基因Per家族基因及其同腫瘤相關性的研究，有望為未來時辰治療提供堅實的理論基礎及對時辰治療模式改進提供一種新的探索途徑。

1 Per家族基因

Per家族基因廣泛存在于原核生物和真核生物中。Yagita等[1]研究表明，在哺乳動物中Per基因的中樞調節點位于下丘腦視交叉上。Per家族基因的啟動子上游均帶有E-box序列，因此CLOCK等基因可分別與Per家族基因的調控蛋白相結合，激活基因轉錄生成Per家族基因mRNA，在核內產生的mRNA, 通過一定的正反饋路徑進入細胞質合成相應的蛋白質[2]，即Per1、Per2、Per3蛋白。在遺傳學研究中提示，體內生物鐘重要的調節因子CKIε,其主要的反應底物則是Per2蛋白。Per2的激酶結合區域的調節因子CKIε若發生磷酸化突變，將會導致CKIε的活性降低，從而使人體內部晝夜節律的長度縮短。同時Per2蛋白自身的磷酸化也可以被蛋白激酶及蛋白磷酸酶調控，蛋白激酶及蛋白磷酸酶活性的降低將導致Per2蛋白的磷酸化、泛素化及降解[3-4]。一項關于小鼠的研究也表明，Per家族基因主要通過兩個機制抑制腫瘤的形成：一方面促進細胞對射線引起的DNA損傷進行自身修復；另一方面通過對抑癌基因p53的調控發揮作用[5]。

2 Per家族基因與腫瘤之間的關系

2.1 Per2基因與非小細胞肺癌的關系

目前全球范圍內，肺癌的發病率及病死率均居惡性腫瘤之首，5年生存率僅為16.8%[6]。我國2010年的一項調查研究結果也提示肺癌的發病率和病死率居所有惡性腫瘤的第一位[7]。目前時鐘基因的核心基因Per家族基因在肺癌中的研究相對較少。池闖等[8]采用免疫組化法檢測60例非小細胞肺癌與同期肺大皰和肺囊腫接受手術治療的20例患者的正常肺組織中Per2蛋白表達情況，比較發現：Per2蛋白在非小細胞肺癌組織中陽性表達率為71.7%，而在正常肺組織中陽性表達率高達95%，差異有統計學意義(P=0.030)。同時Ⅰ期肺癌患者Per2蛋白的陽性表達率為86%，而Ⅲ期肺癌患者陽性表達率僅為50%，差異有統計學意義(P=0.046)。上述實驗結果顯示：Per2蛋白在非小細胞肺癌中的表達明顯降低；同時腫瘤TNM分期越晚，Per2蛋白陽性表達率也越低。

2.2 Per家族基因與腹部腫瘤的關系

腹部腫瘤作為人類常見腫瘤之一，目前相關手術、放化療治療的研究取得了不小的進展，但腹部腫瘤尤其是肝癌、胰腺癌等的死亡率仍較高。因此尋找影響腹部腫瘤發生發展起重要作用的基因，研究其功能，對評價預后、早期診斷及研制基因藥物具有重要作用。Mazzoccoli等[9]選取了19例09：00～17:00接受直腸癌根治術的患者，采用實時定量PCR法檢測腫瘤組織中Per基因的表達情況，發現生存率低的患者Per基因表達下調水平高于生存率高的患者，差異有統計學意義(P=0.026)。王雅平等[10]共收集38例未經放化療的結腸癌病例，每例分別取腫瘤組織及腫瘤邊緣5 cm以上的正常組織，通過免疫組化法檢測發現，38例患者中Per2蛋白在癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為81.6%及97.7%(P<0.05)。T1a～T2期的9例病例中，Per2蛋白表達下調33.3%，而T3～T4期的29例病例中，Per2蛋白表達下調72.4%(P<0.01)。其結果顯示Per2蛋白在結腸癌組織及正常結腸組織中均有表達，但癌組織較正常組織表達明顯下調，且TNM分期越晚，表達程度越低。Yang等[11]在一項關于肝細胞肝癌的實驗中也提示，Per家族基因在肝細胞肝癌組織中的表達為低表達。另外，該研究還發現，在缺氧情況下，肝癌細胞中Per家族基因的表達與不缺氧環境下培養的肝癌細胞相比明顯下降，這說明環境因素特別是氧含量的變化將會影響Per家族基因的表達[12]。金濤等[13]在一項關于乙肝病毒X蛋白(Hbx)在正常肝細胞組織表達的研究中表明，轉染了Hbx后，肝細胞中Per家族基因表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。而乙肝作為肝癌的常見誘因，也間接預示Per基因的表達與肝癌的發生密切相關。在胰腺癌的研究中，Relles等[14]選取了2005年至2012年上午10點至下午2點行胰腺癌腫瘤切除術的65例病例，采用實時定量PCR法檢測的結果表明：Per1、Per2、Per3基因表達水平降低，隨后他們根據基因表達水平將65例病例分為兩組，一組為相對高表達組，一組為相對低表達組，統計2年生存率發現，Per1相對高表達組和相對低表達組兩年生存率分別為42.9%、21%(P=0.026)，Per2相對高表達組和相對低表達組兩年生存率分別為47.6%、18.7%(P=0.040)，Per3相對高表達組和相對低表達組兩年生存率分別為43.3%、24.3%(P=0.040)。上述結果提示，Per基因的低表達與胰腺癌患者低生存率之間具有密切聯系。

2.3 Per家族基因與乳腺癌之間關系

目前，乳腺癌已成為女性發病率最高的惡性腫瘤之一。2008年，GLOBOCAN針對全球約1 270萬癌癥病人及760例癌癥死亡病例患者的分析，首次證實乳腺癌的發病率及死亡率已躍居女性惡性腫瘤首位。在我國目前乳腺癌的發病率約為55/10萬。流行病學研究表明，長期上夜班的女性人群乳腺癌的發病率明顯高于正常上班的人群，可見晝夜節律的紊亂與乳腺癌的發生具有密切聯系。在一項關于散發性及家族性乳腺癌的研究中，Winter等[15]共選取34例散發乳腺癌病例及11例家族性乳腺癌病例，通過PCR法檢測發現，散發性乳腺癌病例中Per1、Per2的平均表達量為1.8(P<0.001)、3.6(P<0.05)，而家族性乳腺癌病例中Per1、Per2的平均表達量僅為0.9、2.6，差異有統計學意義(P<0.001)。更重要的是，無論是家族性乳腺癌還是散發性乳腺癌，其Per1、Per2的表達水平較正常乳腺組織均下降。進一步研究中他們又將乳腺癌病例分為Per1相對低表達組和Per1相對高表達組進行比較發現，Per1相對低表達的病例中有50%的患者中雌激素受體處于非激活狀態而Per1相對高表達的病例中僅有15.4%的患者雌激素受體處于非激活狀態。但并未發現Per2基因與雌激素受體具有相關聯系，這也暗示Per1低表達可能與激素受體功能異常有關。在多項關于Per基因同乳腺癌關系的研究中，都證實乳腺癌患者Per基因的啟動子大量甲基化。而關于Per3基因的多態性與乳腺癌發生的相關性，也在國外得到了大量報道及證實。Zhu[16]等收集了389例白種人乳腺癌患者及432例正常白種人婦女血液標本，利用PCR法檢測發現，乳腺癌患者中Per3基因型為陽性純合子Per+/+的患者有36名，占乳腺癌患者的9.3%，略高于正常人中的6.5%。他們又將乳腺癌患者分為絕經期及絕經后2個階段，進一步分析發現絕經前乳腺癌患者中基因型為Per3+/+和Per3+/-的患者比例為62.5%，而正常婦女中僅為49%。在絕經后婦女中則未能發現明顯差異。這也表明Per3基因的多態性與乳腺癌發生具有明顯相關性，尤其是在絕經前的婦女中，大多數患者具有明顯家族病史，這也可能與絕經前婦女相較于絕經后發病患者，其可能繼承更多遺傳風險因子有關。

2.4 Per家族基因與頭頸部鱗癌的關系

頭頸部惡性腫瘤是指從顱底到鎖骨上、頸椎前這一解剖范圍內的所有惡性腫瘤，一般不包括顱內、頸椎及眼內的惡性腫瘤。頭頸部腫瘤病理類型較多，但大部分為鱗癌，占90%以上。 關于時鐘基因與頭頸部鱗癌關系的研究尚處于初級階段。Hsu等[17]于2009年至2011年期間共收集了40例頭頸部鱗癌標本，采用實時定量PCR法檢測發現，癌組織中Per1、Per2、Per3、Cry2基因表達較正常組織表達下調，他們根據患者臨床分期將Ⅰ～Ⅱ期分為一組，Ⅲ～Ⅳ期為一組，進一步分析發現，Per3基因的下調程度與腫瘤分期明顯相關，Ⅲ～Ⅳ期患者中Per3基因下調程度明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者。而在關于Per基因同腫瘤大小的研究中，40例標本根據腫瘤直徑是否超過3cm分為兩組比較發現，Per3基因在腫瘤大于3cm組中其表達程度較小于3cm組明顯下調。同時他們發現腫瘤浸潤程度大于1cm的標本中Per3基因的表達量也明顯低于腫瘤浸潤程度小于1cm的標本。上述實驗結果均具有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，Per1、Per2、Per3基因表達均在頭頸部鱗癌組織中出現了下調，但只有Per3基因同腫瘤的分期、大小、浸潤程度具有明顯相關性。在人口腔黏膜細胞Per1基因表達晝夜節律性的研究中，Bjarnson等[18]發現正常人口腔頰黏膜細胞中Per1mRNA的表達具有24h晝夜節律性，Per1mRNA表達峰值出現于活動相早期(07：58am)，谷值出現于活動相和休息相的轉化時期(00:00am)，峰值比谷值高3.33倍(P<0.05)。而在進一步研究中，Zhao等[19]通過對口腔黏膜鱗癌組織的研究，發現Per1mRNA表達具有晝夜節律性并且發現調低Per1基因表達水平可增加腫瘤淋巴結轉移的可能，這提示了Per1基因表達水平在抑制腫瘤轉移中具有重要作用。Chen等[20]也在關于Per家族在口腔鱗癌表達水平的研究中發現，Per家族基因在癌組織中較正常組織表達量降低(P<0.05)。在牙齦癌的研究中，Hastings等[21]的一項研究表明Per1、Per2、Per3基因在牙齦組織及牙齦癌中均有表達，Per3基因在牙齦癌組織中的表達較癌旁組織明顯下降(P<0.05)。進一步研究中，Sato[22]等選取了人類牙齦癌細胞系CA9-22與人類牙齦正常成纖維細胞，通過免疫組化、實時定量PCR法分析比較，發現Per1基因主要表達于細胞核中，其在正常牙齦成纖維細胞中表達水平顯著高于人類牙齦癌細胞中的表達，而在另一方面，Per3基因則主要表達于細胞質中，在牙齦癌組織中表現為低表達。這提示Per1、Per3基因在牙齦癌細胞中具有抑制腫瘤發生發展的作用，其表達在腫瘤發展中相互獨立。從上述研究中可以發現，Per家族基因表達水平在頭頸部腫瘤組織中明顯下調且其表達水平具有晝夜節律性，這也為后續頭頸腫瘤研究開辟了一個新的探索途徑。

3 Per家族基因同時辰放化療之間關系的研究

化療及放療作為治療腫瘤的主要治療方式，其治療效果已得到了廣泛認同。隨著對生物節律性研究的深入及時間治療模式的提出，在此基礎上逐漸出現了一種新的治療模式—時辰放化療。時辰化療利用化療藥物作用于處于不同周期的腫瘤細胞起到殺滅腫瘤細胞的作用；在長期研究中發現正常組織與腫瘤組織在放射敏感性方面具有生物節律差異，時辰放療即是選擇腫瘤組織對射線敏感期放療同時避開正常組織射線敏感期。根據生物的節律選擇特定時間實行放化療，可以達到最大化殺傷腫瘤細胞、減輕放化療的相關毒副作用[23]。

化療方面，國外學者Sato[22]等在順鉑治療牙齦癌的研究中發現，將順鉑作用于牙齦正常成纖維細胞中，其Per1和Per3基因的表達量無明顯變化。而經順鉑治療后的牙齦癌細胞中Per1和Per3的基因較加入藥物前明顯增高，進一步研究發現，Per1表達量增高能協同順鉑共同作用于牙齦癌細胞降低牙齦癌細胞的生存能力，并且他們發現加入順鉑的正常成纖維細胞中，Per3基因表達較高的成纖維細胞其生存能力較強，這些結果表明Per1、Per3基因能協同順鉑共同作用于腫瘤細胞，降低腫瘤細胞的生存能力，同時能增強正常細胞對順鉑的耐受程度從而減少正常細胞的死亡。Per家族基因作為時鐘基因其表達水平具有明顯晝夜節律性，以上研究提示我們，Per基因表達量的增高有助于提高牙齦癌的治療療效，而根據基因表達水平選擇化療藥物給藥高峰時間則是時辰化療的核心內容。在治療卵巢轉移癌、肺癌、乳腺癌、白血病等疾病中，許多長期臨床試驗都證明時辰化療相較于傳統治療方式具有更好的治療效果及更輕的化療毒副反應，尤其是對于仍然具有正常生物節律的患者[24-25]，而根據Per基因表達量的變化改變時辰化療模式將在后期關于減輕患者化療毒副反應同時提高患者療效的研究中提供一種新的研究途徑。

放療方面，在晝夜節律基因對食管癌細胞株(Eca 109)放射敏感性影響的研究中，晝夜節律基因Perl和Per2表達高峰時照射與低谷時照射比較發現，腫瘤細胞凋亡率減少，說明晝夜節律基因Perl和Per2高表達，能夠降低食管癌細胞的放射敏感性[26]，但體內研究得出了不同的結果。在最近一篇關于腦膠質瘤動物模型研究中，Niu[27]等測定出正常腦組織中Per1基因表達在早上8點到達高峰，之后逐漸下降，在20點至24點到最低谷；而膠質瘤中其表達高峰位于4點并在12點降至低谷。正常腦組織中Per2則于早上0點開始升高并于12點達到高峰，之后逐漸下降并于24點降至低谷，但膠質瘤中Per2基因于0點出現表達高峰并在8點降至低谷。研究者根據Per1基因晝夜變化節律于12點給予放射治療，12點接受照射的動物其Per1基因表達水平明顯高于未接受照射組；另一方面他們根據Per2基因的晝夜節律變化分別于0點、4點進行放射治療，發現正常組織中治療組與對照組其Per2基因表達水平無明顯差異，而在膠質瘤組織中，治療組Per2基因表達水平明顯高于對照組。進一步研究發現膠質瘤組織中Per1、Per2基因表達高峰時進行放射治療，其腫瘤細胞凋亡率明顯高于Per1、Per2基因低表達時行放射治療的膠質瘤組織，而這些實驗結果也表明根據Per1、Per2基因的晝夜節律變化調整放射治療時間能有效提高放射治療療效。

4 結 語

綜上所述，隨著對Per家族基因研究的不斷深入，Per家族基因的調控作用及其在惡性腫瘤中的表現形式不斷得到新的認識。時辰治療的研究目前尚處于初步臨床研究階段，缺乏大量基礎研究的支撐。而關于Per家族基因的研究，將對時辰治療的理論研究提供一個新的探究思路。雖然目前Per家族基因同時辰治療之間聯系的研究尚處于初級階段，但在腫瘤治療模式逐步向個體化治療轉化的趨勢下，這樣的研究無疑將為腫瘤治療提供一種新的治療方向。

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2016- 03- 18

2016- 07- 20

*國家自然科學基金項目(81560437)

王 睿(1989-)，男，侗族，四川樂山人，碩士，醫師，主要從事頭頸部腫瘤基礎與臨床研究。

△金 風(1963-)，主任醫師，教授，碩士生導師，E-mail ：jinf8865@yeah.net

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A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.04.007