GeneXpert MTB/RIF技術的應用進展及其在骨關節結核診斷中的價值

李禎 馬遠征 秦世炳

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·綜述·

GeneXpert MTB/RIF技術的應用進展及其在骨關節結核診斷中的價值

李禎 馬遠征 秦世炳

結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測體系 (GeneXpert MTB/RIF) 是一套整合核酸準備、擴增、實時檢測的完全自動化檢測臨床標本診斷結核分枝桿菌和利福平耐藥的技術，已被美國認可為結核快速分子學診斷技術，世界衛生組織也推薦GeneXpert MTB/RIF在中低收入國家可替代涂片鏡檢去檢測肺結核。GeneXpert MTB/RIF用于檢測來自各個肺外結核部位(比如淋巴結)的組織樣本都有更好的表現；相比于結核分枝桿菌的培養檢測，GeneXpert MTB/RIF在結核病快速診斷中的高敏感度也使其成為一種更好的選擇。然而，對于GeneXpert MTB/RIF用于可疑性骨關節結核診斷時，檢測膿液標本的推薦數據卻相當少。為探討新的結核病診斷技術在骨關節結核診斷中的可行性，作者將介紹GeneXpert MTB/RIF的檢測原理、及其在病原體診斷方面的臨床應用和存在問題，以及發展前景。

結核，骨關節； 熒光定量核酸擴增檢測技術； 診斷

結核病是一個重要的全球公共衛生問題，對結核病進行及時準確的早期診斷和耐藥檢測對控制結核病疫情至關重要[1]。肺外結核繼發于肺部感染的血源性播散，能使結核分枝桿菌出現在任何解剖部位[2]。在中國，肺外結核約占全部結核病的10%～20%，骨關節結核約占肺外結核病患者的11.3%～34.5%[3]，但現有的骨關節結核診斷技術在診斷的準確性、時間跨度和耐藥檢測上存在很大限制，使骨關節結核的診斷面臨巨大的挑戰，以至于很多患者早期大量接受經驗性廣譜抗生素治療，而早期判斷結核分枝桿菌和耐藥情況是結核病提高成功治愈率和降低傳染性的首要因素。GeneXpert MTB/RIF是近些年出現的結核分枝桿菌分子檢測技術，在2010年9月，為指導GeneXpert MTB/RIF技術的使用，WHO組織專家組對GeneXpert MTB/RIF檢測的準確性進行綜述性分析，于2011年初推出關于GeneXpert MTB/RIF應用的政策性指南，其在臨床工作及結核病控制中的應用也被證實。 Theron等[4]研究結果顯示GeneXpert MTB/RIF可由未經專業培訓的護士操作，并可提高當日診斷率； Davis等[5]研究認為引進GeneXpert MTB/RIF診斷策略，會降低對非特異性臨床癥狀和標準策略的依賴，參考GeneXpert MTB/RIF檢測的高敏感度檢測結果，能避免多數不必要的過程(比如經驗性四聯抗結核治療及住院治療天數)，在當前有著較高的診斷準確性及臨床應用價值。但GeneXpert MTB/RIF在骨關節結核的檢測效能和臨床應用的文獻卻相對較少，筆者根據GeneXpert MTB/RIF檢測的分子學原理，及其對肺結核和肺外結核的檢測效能，探討GeneXpert MTB/RIF在骨關節結核診斷中的應用前景。

GeneXpert平臺介紹及其技術原理

一、 GeneXpert 平臺的介紹

全自動快速分子病原學診斷檢測系統GeneXpert由美國國防部資助，擬用于全美郵政系統中炭疽病毒的檢測[6]。該系統主要由2部分組成[7]：①Xpert塑料囊盒；②Xpert儀器。其是全球惟一的一套全自動一體化的半巢式熒光PCR檢測系統，該系統將PCR檢測所需的3個步驟(樣品準備、DNA擴增、檢測)設定于一體，對樣品完全自動化地進行核酸提取、純化及濃縮，這些復雜步驟都在檢測試劑盒內完成，并且擴增與檢測也在GeneXpert反應盒中完成。GeneXpert系統對所要檢測的DNA序列具有很高的敏感度，加上即時的光學檢測軟件使得一旦發現目標基因便可以得出結果，極大地減少了檢測所需時間。GeneXpert系統應用到結核病診斷領域中被稱作Xpert MTB/RIF檢測技術，可以在2 h內直接從檢測標本中判斷是否含有結核分枝桿菌及其對利福平的耐藥性，而整個檢測過程都在Xpert儀器里進行，處于相對密閉環境中，需要人工操作的時間不超過5 min，所以操作者和周圍環境比較安全[8]；一項多中心、隨機、對照試驗評估了GeneXpert MTB/RIF檢測技術的可行性、準確性和臨床療效，結果顯示GeneXpert MTB/RIF檢測技術可以在初級醫療機構由護士準確操作[4]。

二、GeneXpert MTB/RIF的技術原理

GeneXpert MTB/RIF 試驗是以半巢式PCR技術為基礎，全自動擴增核酸檢測的技術。研究顯示，95%以上的利福平耐藥結核分枝桿菌有rpoB基因突變，同時所有的利福平敏感結核分枝桿菌在rpoB基因都有相同的核酸序列，說明通過檢測rpoB基因可以判斷是否存在結核分枝桿菌及利福平耐藥[9-10]。故GeneXpert MTB/RIF檢測原理是以結核分枝桿菌的利福平耐藥基因rpoB作為靶基因。依據靶基因的81 bp核心區設計出5條重疊的探針，同時根據球芽孢桿菌的基因組設計1條對照探針，通過這6條探針的熒光顯示結果對標本中的結核分枝桿菌進行檢測[11]，當5條檢測探針未能與檢測基因配對結合，全部無熒光釋放，只有第6條探針顯示熒光，結果判定為陰性；當5條檢測探針能特異的與目標基因序列配對結合，5條檢測探針均發出熒光，結果判定為陽性且利福平敏感；當5條檢測探針不能完全與目標基因序列配對結合，5條檢測探針中有1條或者多條探針未顯示出熒光，結果判定為陽性且利福平耐藥。考慮到大多數的利福平耐藥性結核分枝桿菌也對異煙肼耐藥，所以在一定程度上可以通過GeneXpert MTB/RIF檢測出的利福平耐藥結果判斷結核分枝桿菌為耐多藥結核分枝桿菌[12]，因此GeneXpert MTB/RIF檢測方法可以作為初步判斷耐多藥結核病的一種技術。

三、GeneXpert MTB/RIF的優缺點

1．GeneXpert MTB/RIF的優勢[13]：(1)模塊化的平臺，操作簡單，操作者不需要正規的實驗室訓練；(2)較高的結核病診斷準確率；(3) 快速出結果(2 h)；(4)同時檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥性；(5)密閉的系統，交叉污染率低，不需要先進的生物安全設備。

2. GeneXpert MTB/RIF的缺陷[14]：(1)Xpert儀器設備和檢測用的塑料囊盒較為昂貴，很難實現短時間內普及；(2)GeneXpert MTB/RIF技術只能對部分特定菌種進行檢測，限制其使用范圍；(3)有時出現利福平耐藥性的假陽性結果；(4)只能檢測到是否存在結核分枝桿菌的DNA，不能用于檢測治療效果和復發病例；(5)對于細菌含量極少的標本(如腦脊液)檢出率很低。

GeneXpert MTB/RIF在結核分枝桿菌及利福平耐藥診斷中的應用現況

一、GeneXpert MTB/RIF在肺結核領域的應用進展

GeneXpert MTB/RIF對于肺結核的診斷以及利福平耐藥性的判斷已經得到深入研究并被廣泛接受。2010年，Boehme等[15]應用GeneXpert MTB/RIF 對肺結核的診斷進行了全面的評估，選取1730例疑似肺結核患者進行檢測，并與傳統痰涂片、陽性痰涂片培養、藥敏試驗以及傳統核酸擴增檢測方法相比較，結果如下：(1)對于涂片陽性、培養陽性的臨床標本，GeneXpert MTB/RIF的檢出率為 98.2% (551/561);對于涂片陰性、培養陽性的標本， GeneXpert MTB/RIF的1次檢出率72.1% (124/172)，如果復檢2或3次，可使涂片陽性、培養陽性患者的檢出率分別達到 90.2%和85.1%。(2) GeneXpert MTB/RIF對于非結核病患者檢測的特異性達 87.0% (604/694)。(3)與傳統藥敏試驗相比， GeneXpert MTB/RIF對利福平耐藥患者的檢出率達97.6%(200/205)，對利福平敏感患者的檢出率達98.1%(504/514)，研究結果還顯示GeneXpert MTB/RIF可以對未處理的痰標本在2 h內檢出結核分枝桿菌及利福平耐藥性；同年12月WHO發表聲明，認可并推薦GeneXpert MTB/RIF在結核病防治規劃中的應用，同時指出， GeneXpert MTB/RIF的出現對肺結核的診治具有里程碑式的意義[16]。2011年，Boehme 等[17]為了再次驗證GeneXpert MTB/RIF，對6648例疑似肺結核患者進行檢測，進一步驗證了該技術對肺結核診斷和利福平耐藥性判斷的準確性和有效性。但是2014年Rufai等[18]的一項研究認為GeneXpert MTB/RIF對利福平耐藥性檢出率較低，會低估耐藥結核病的負擔，建議根據不同地區設計特異性的探針來增加GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度。

二、 GeneXpert MTB/RIF在肺外結核領域的應用進展

目前，結核病仍然是世界衛生健康的一大挑戰，主要原因在于診斷困難，其金標準陽性率低、敏感度差。肺外結核的診斷尤為困難，原因在于肺外結核病灶中結核分枝桿菌數量一般較少，同時不易獲得位于人體深部組織的結核病灶的病變標本[19]。因此，相對于肺結核，肺外結核用于診斷的形式較少，診斷更為困難，不利于臨床治療。GeneXpert MTB/RIF是診斷結核病的新技術，目前已在臨床中廣泛用于痰標本的肺結核診斷，但是其在肺外結核診斷中的價值還沒有完全統一認識，因此2013年賈留群等[20]用 Meta分析方法來評估相關學者應用GeneXpert MTB/RIF試驗對肺外結核的診斷價值，以期得到GeneXpert MTB/RIF在肺外結核應用的循證醫學證據。結果顯示，GeneXpert MTB/RIF對肺外結核有較好的特異度，對確診肺外結核有很好的價值，但是其對于肺外結核診斷的敏感度較差；亞組分析提示GeneXpert MTB/RIF對于不同組織的肺外結核具有不同的診斷價值，提示只有進一步研究GeneXpert MTB/RIF在不同肺外結核組織標本中的診斷應用，才能得到其在不同臨床患者診斷中的價值，以更好地指導臨床工作。因此，賈留群等[20]提出開展肺外結核不同組織標本檢測的大樣本研究來進一步證實GeneXpert MTB/RIF試驗對肺外結核的診斷價值。在肺外結核中，不同的組織或液體標本在 GeneXpert MTB/RIF 試驗中陽性率有所不同。有研究詳細評估了GeneXpert MTB/RIF在非呼吸道標本中(腦脊液、胃液、組織、胸水等)診斷肺外結核病的價值[21-23]，結果顯示，盡管GeneXpert MTB/RIF試驗的檢測敏感度尚可(77.3%～95.0%)，但仍以臨床綜合診斷作為肺外結核病診斷的直接參考標準。尹青琴等[24]對GeneXpert MTB/RIF用于各類結核病的Meta分析顯示，肺外結核的總體敏感度為76.0%，不足以篩查肺外結核病，可能與不同肺外結核組織標本中結核分枝桿菌數量多少(如腦脊液的細菌含量較少[25])有關。相對于常規肺外結核檢測試驗，目前WHO已推薦使用GeneXpert MTB/RIF試驗診斷淋巴結和其他組織的結核，以及結核性腦膜炎的首選初始診斷[25]。

GeneXpert MTB/RIF在骨關節結核領域的應用前景

一、GeneXpert MTB/RIF在骨關節結核領域的應用

骨關節結核屬于肺外結核常見的一種，其在臨床上的診斷是一個難點，很多患者從出現不適癥狀到最終確診往往需要幾個月到幾年的時間，嚴重影響了治療的及時性。隨著影像學的發展，磁共振成像(MRI)技術輔助診斷骨關節結核的推廣使用，使得診斷所需時間有所提前。然而結核病最直接可靠的證據是細菌學診斷，但是骨關節結核病灶不易獲得樣本且培養陽性率低，使得細菌學診斷在骨關節結核的診斷中沒能很好地發揮其作用。GeneXpert MTB/RIF技術通過檢測痰標本來診斷肺結核，但由于骨關節結核所提供的標本為膿液和肉芽組織，與肺結核患者的痰標本在性質方面存在較大差異，不同樣本類型會對試驗結果產生極大影響，再加上不同的樣本處理技術也會不同程度地影響診斷準確性，特別是樣本均一化步驟對試驗準確性的影響。其原因如下：處理不同可能會造成樣本顆粒阻塞暗盒閥門影響其在樣本容器中的質量，從而引起不同解釋的結果；其次會影響細菌載量。因此需針對不同性質標本進行不同處理，盡可能減少樣本帶來的誤差。WHO根據不同組織的預處理做出推薦[27]，骨關節結核標本的預處理可參照處理淋巴結和其他組織的推薦步驟：(1)使用無菌鉗和剪刀在一個無菌的研缽中(或在均質器或組織磨床中)將組織標本切成小塊；(2)加入大約2 ml無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)；(3)用研缽和研杵研磨組織和PBS的混合液(或在均質器或組織磨床中)，直至得到均勻懸浮液；(4)用移液管吸取約0.7 ml的均質懸浮組織液至無菌的錐形螺旋帽管，注意避免將未完全研磨的塊狀樣本移入；(5)用移液管吸取兩倍的Xpert樣本試劑(1.4 ml)至0.7 ml的均質懸浮組織液；(6) 大力搖晃試管10～20次或渦旋至少10 s；(7)在室溫條件下靜置10 min，然后再大力搖標本10～20次或渦旋至少10 s；(8)在室溫下再次靜置樣品5 min；(9) 使用新的移液管，吸取2 ml的處理樣品到GeneXpert檢測盒；(10)按照儀器說明將GeneXpert檢測盒放入GeneXpert檢測儀。由于不同樣本預處理操作提供了GeneXpert MTB/RIF檢測的標本基礎，使GeneXpert MTB/RIF技術應用在骨關節結核的診斷具有一定的可行性，但是仍需骨關節結核病灶大樣本量的研究來進一步證實 GeneXpert MTB/RIF試驗對骨關節結核的診斷價值。

二、GeneXpert MTB/RIF技術在骨關節結核領域的應用前景

WHO于2013年推薦GeneXpert MTB/RIF用于診斷肺外結核[28]。2014年李力韜等[29]開展了GeneXpert MTB/RIF對脊柱結核臨床標本行結核分枝桿菌與利福平耐藥性檢測的驗證性研究，實驗以細菌培養及表型藥敏試驗為參考標準。結果顯示，140例臨床診斷的脊柱結核標本中，GeneXpert MTB/RIF檢測的陽性檢出率為63.57%(89/140)；其中64份培養陽性標本中， GeneXpert MTB/RIF的敏感度為98.44%(63/64)；76份培養陰性標本中，GeneXpert MTB/RIF的敏感度為34.21%(26/76)。表型藥敏試驗判斷的耐藥結核中，GeneXpert MTB/RIF對利福平耐藥性檢測的敏感度為93.33%(28/30)，特異度為94.12%(32/34)。得出的結論是GeneXpert MTB/RIF能夠同時對脊柱結核標本行結核分枝桿菌檢測與利福平耐藥性檢測，具有很好的臨床應用價值。2015年秦世柄等[30]比較了GeneXpert MTB/RIF和分子線性探針技術(MTBDRplus)在骨關節結核的診斷價值，根據復合參考標準(composite reference standard，CRS)， GeneXpert MTB/RIF、MTBDRplus檢測的敏感度分別為82%(41/50)、72%(36/50)，而特異度均為100%。其中對于24例確診骨關節結核，GeneXpert MTB/RIF和MTBDRplus的敏感度分別為100.00%(24/24)、87.50%(21/24)；22例高度疑似骨關節結核中，GeneXpert MTB/RIF和MTBDRplus的敏感度分別為72.73%(16/22)、63.64%(14/22)；對于疑似骨關節結核患者，GeneXpert MTB/RIF和MTBDRplus檢測的敏感度均為25.00%(1/4)；對24例羅氏固體培養基培養陽性的標本進行絕對濃度法藥物敏感性試驗(DST)，并以DST為參考， GeneXpert MTB/RIF檢測利福平耐藥符合率為100%。從上述研究結果中可以得出，GeneXpert MTB/RIF有較一致的高特異度，但敏感度有差異且不理想；高特異度表明GeneXpert MTB/RIF技術在肺外結核快速診斷中發揮重要作用，然而，不理想的敏感度可能妨礙GeneXpert MTB/RIF技術在肺外結核中的作用，特別是對于羅氏固體培養基培養陰性、臨床懷疑骨關節結核、且GeneXpert MTB/RIF檢測結果為陰性標本時，還不能完全排除骨關節結核的可能性，需要進一步做其他相關檢測以明確診斷。Denkinger等[26]對18項研究、共計4461例樣本進行了綜述和Meta分析，由于各個研究中樣本類型和前處理措施差異較大，致GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度亦差異較大；在淋巴結或其他穿刺組織中，GeneXpert MTB/RIF與羅氏固體培養法相比的總敏感度為83.1%，與復合參考標準CRS(包括Xpert之外的其他核酸擴增實驗、組織學、痰涂片、生化檢測、癥狀或診斷性治療的反應等)相比的總敏感度為81.2%；在腦脊液標本中，GeneXpert MTB/RIF與培養相比的總敏感度為80.5%，與CRS相比的總體敏感度為62.8%；與CRS相比，GeneXpert MTB/RIF對各類樣本的總特異度均>98.7%。由此可見，GeneXpert MTB/RIF技術對于骨關節結核的診斷效能與其在各類肺外結核的總體診斷效能相似，說明了在臨床上應用GeneXpert MTB/RIF診斷骨關節結核的可行性，GeneXpert MTB/RIF技術對于骨關節結核的快速診斷有至關重要的作用。

GeneXpert MTB/RIF技術的總結和展望

GeneXpert MTB/RIF對于肺結核的診斷特異度和敏感度已經得到廣泛認可，從上述內容可以認為GeneXpert MTB/RIF在肺外結核診斷方面有較高臨床應用價值，但還需進一步開展更多試驗來驗證該技術在不同肺外結核的診斷價值。根據上述國內外學者的研究， GeneXpert MTB/RIF能夠提高結核病，特別是痰涂片抗酸桿菌檢查陰性結核病的診斷率；減少診斷時間，增加結核病治愈率；降低結核病發病率、死亡率和傳染率等，初步驗證了其在骨關節結核中的臨床應用，可在有條件的醫院開展。針對GeneXpert MTB/RIF的普及率低、檢測菌種單一、假陽性多等不足，在日后應積極開展提升GeneXpert MTB/RIF檢測能力的相關研究，進一步深化GeneXpert MTB/RIF的研究，普及該技術用于各部位結核病的篩查，使其診斷快速、廣泛和精準的優勢盡早地在臨床診治中得到發揮。

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(本文編輯：孟莉 范永德)

The current application of GeneXpert MTB/RIF assay and evaluate the feasibility of the assays in the diagnosis of bone and joint tuberculosis

LIZhen*，MAYuan-zheng，QINShi-bing.

*ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China

MAYuan-zheng,Email:myzzxq@sina.com

Mycobacteriumtuberculosis/rifampin resistance real-time quantitative nucleic acid amplification detection system (GeneXpert MTB/RIF system) is a set of integrated technique including nucleic acid preparation, amplification and real-time detection for fully automatic detection ofMycobacteriumtuberculosisand rifampin resis-tance in clinical specimens. It has been recognized as a rapid molecular diagnosis method of tuberculosis in USA. World Health Organization recommended that GeneXpert MTB/RIF system could replace the smear to diagnose the pulmonary tuberculsis in low and middle income countries. GeneXpert MTB/RIF was used to detect tissue samples from extra-pulmonary tuberculosis (such as lymph nodes) with better performance. Compared with the mycobacte-rial culture, higher sensitivity of GeneXpert MTB/RIF is a better choice for the rapid diagnosis of tuberculosis. GeneXpert MTB/RIF was used in the diagnosis of suspected bone and joint tuberculosis. However, few detection data of pus specimens are available. To study the feasibility of new diagnostic techniques in the diagnosis of bone and joint tuberculosis, this paper introduces the detection principle, clinical application in the detection of pathogens, exi-sting problems and prospect of GeneXpert MTB/RIF system.

Tuberculosis，Bone and joint； GeneXpert MTB/RIF system； Diagnose

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.04.019

北京市科技計劃課題(D141107005214002)

030001 太原，山西醫科大學(李禎)；解放軍第三〇九醫院骨科中心(馬遠征)；首都醫科大學附屬北京胸科醫院骨科(秦世炳)

馬遠征，Email: myzzxq@sina.com

2016-02-17)