熱回流技術提取長裙竹蓀多糖的工藝研究

劉曉英　劉光榮

本研究為了優化熱回流法提取竹筍多糖的提取工藝，以多糖提取率為指標，通過單因素及正交實驗對提取工藝進行優化，主要考察了提取料液比、時間、提取pH等因素。研究結果顯示熱回流法提取長裙竹蓀多糖的最優工藝為料液比（110：1）、時間（2小時）、提取pH（5.0），采用此條件下提取長裙竹蓀多糖提取率為（18.65±0.259）%，同時該工藝具有良好精密度與重復性，適用于長裙竹蓀多糖的提取。

多糖為生命代謝活動中不可或缺的重要部分，是幾個或多個單糖之問通過糖苷鍵連接形成的高分子化合物，可廣泛地參與人體的各項活動，如抗衰、增強免疫力、皮膚保濕、抗腫瘤、抗病毒等。目前化妝品中皮膚保濕劑主要包括化學保濕劑（如甘油、丙二醇）和多糖保濕劑（如透明質酸、植物多糖）。由于從動植物中提取的多糖類物質具有天然、安全無刺激、與皮膚親和力較高等優勢，因此多糖類物質在化妝品中的應用受到了人們的廣泛關注，可滿足人們對高品質化妝品的需要。目前已知的多糖研究主要有植物多糖、動物多糖、真菌多糖、細菌多糖、藻類多糖等，其中真菌多糖的研究是目前的一個熱點。

竹蓀為高蛋白、多氨基酸、多維生素、低脂肪、營養豐富的食藥兼用的高等真菌竹蓀菌蓋，多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中，葡萄糖含量最高，其次是半乳糖和甘露糖。竹蓀菌蓋多糖具有較好的還原能力和抑制羥基自由基能力。隨著菌蓋多糖質量分數的增加，其還原能力和抑制羥基自由基能力有定程度提高，其中菌蓋多糖的還原能力與質量分數具有一定的線性相關性。據文獻報道，竹蓀提取液在化妝品中的應用很少，并且對其作用機理尚未研究；其研究主要是在醫藥（抗癌、抗菌、降血脂）與食品方面（防腐）等方面的報道。竹蓀提取液應用到化妝品中，具有潛在的美白、抗衰老、防曬及抗痤瘡等方面的功效。竹蓀提取液與其他美白劑抗衰劑相比，在起到美白、抗衰作用的同時，還具有多糖固有的保濕作用。若能利用竹蓀菌托、菌蓋來深入研究多糖在食品天然防腐劑、保健品、化妝品中的應用，對我們的生活會影響深遠。

長裙竹蓀（Dictyophora indusiata）是一類大型真菌，又稱竹菌、竹參，從分類學上隸屬于擔子菌亞門、腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬。長裙竹蓀味道鮮美、營養豐富，既是馳名的名貴藥材又是宴席上的名貴山珍，因此素有“菌中皇后”“山中之王”美稱。對于真菌多糖的提取主要有熱水浸提法、酸堿浸提法、超聲波法、微波法、酶法、超聲酶法等，但目前對于長裙竹蓀多糖的提取報道不是很多，主要有熱水提取法及復合酶法等。作為種名貴的食用菌，隨著人們對長裙竹蓀需求量的增大，對長裙竹蓀多糖的研究也逐漸深入，如何在現有提取方法基礎之上加以完善優化以獲得更大提取率的長裙竹蓀多糖非常有研究意義。本研究以長裙竹蓀為研究對象，采取常規的熱回流技術對料液比、提取時問、不同pH等進行了單因素分析及正交試驗，研究了長裙竹蓀多糖的提取工藝，并通過對提取條件的優化篩選了最佳工藝，為進步開發長裙竹蓀的價值提供了依據，希望為竹蓀活性成分在化妝品領域的應用提供科學依據。

1.材料與方法

1.1材料與儀器

長裙竹蓀（購自福建寧德）；苯酚、葡萄糖、硫酸等均為分析純（購自北京化工廠）。

Tecan Genios，型號M200酶標儀（瑞士Tecan公司），移液槍（大龍），天秤（賽多利斯），電子調溫電熱套（江蘇金壇），電子恒溫水浴鍋（江蘇太倉），酸度計（梅特勒托利多）。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線繪制

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖0.1g，置于燒杯中加水溶解定容至100ml，吸取1ml再定容至5ml，得0.2mg/ml標準葡萄糖溶液。準確分別吸取0.2mg/ml標準葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分別置于試管中，各加入蒸餾水使總體積為2.0ml，再分別加5%苯酚試液1.0ml并搖勻，迅速加入濃硫酸5.0ml，搖勻后放置10min，置于沸水浴中加熱10min，取出流水冷卻至室溫，另以蒸餾水2.0ml加5%苯酚和硫酸作空白對照，于490nm波長處測吸光度。結果得到回歸方程Y=0.0686X-0.0003，r=0.999（Y為葡萄糖濃度，mg/ml；x為吸光度值）。多糖提取率按如下公式計算：

1.2.2長裙竹蓀多糖提取的工藝流程

1.2.2 1樣品處理

使用小剪刀將長裙竹蓀剪成0.5cm長短的小塊在65℃下烘干至恒重，密封備用。

1 2.2.2單因素實驗

分別針對料液比、提取時間、不同pH等因素對長裙竹蓀進行提取。其中料液比對長裙竹蓀多糖提取的影響分別考察（50：1）、（70：1）、（90：1）、（100：1）、（120：1）等5個水平；提取時間對長裙竹蓀多糖提取的影響分別考察0.5、1.0.1.5、2.0、2.5等5個水平；不同pH對長裙竹蓀多糖提取的影響分別考察pH=6、7、8、9、10等5個水平。

1）料液比

精密稱取5份1.0g處理后的長裙竹蓀，分別加入蒸餾水50ml（50：1）、70ml（70：1）、90（90：1）、100ml（100：1）、120ml（120：1），在85℃下熱回流提取1h，過濾得到5份溶液并定容至250ml。取樣品溶液0.2ml，加蒸餾水定容至2ml，加入苯酚溶液1ml，加入濃硫酸5ml，在80℃水浴中加熱10min，取出后置于冷水中冷卻，在波長490nm測定吸光度，計算含量（mg/g）。

2）不同提取時間

精密稱取5份1.0g處理后的長裙竹蓀，分別加入100ml蒸餾水，在85℃水浴下，分別熱回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，過濾得到的樣品溶液，取樣品溶液0.2ml加蒸餾水定容至2ml，加入苯酚溶液1ml，加入濃硫酸5ml，在80℃水浴中加熱10min，取出后置于冷水中冷卻，在波長490nm測定吸光度，計算含量（mg/g）。

3）不同pH值

精密稱取5份1.0g處理后的長裙竹蓀，精密稱取5份長裙竹蓀1.0g，剪碎，在85℃下，分別加入100ml，pH值為6、7、8、9、10的蒸餾水，提取2h后過濾，得到樣品溶液，取樣品溶液0.2ml，加蒸餾水定容至2ml，加入苯酚溶液1.ml，加入濃硫酸5ml，在80℃水浴中加熱10min，取出后置于冷水中冷卻，在波長490nm測定吸光度。測定吸光度，計算含量（mg/g）。

1.2.2.3提取工藝正交設計

在單因素實驗基礎之上對提取料液比，提取時間、提取pH進行L9（34）正交試驗，篩選最優提取工藝。同時對篩選出來的最有提取工藝進行精密度、重復性、穩定性等方法學進行考察。

2.結果

2.1提取料液比對長裙竹蓀多糖的影響

以不同料液比提取1次，考察其對提取率的影響，結果見圖1。隨著料液比升高，竹筍多糖提取率逐漸增大，料液比達到100：1時提取率最高，之后開始下降。由此選擇料液比100：1作為最佳料液比進一步篩選其他因素。

2.2提取時間對長裙竹蓀多糖的影響

以不同時間提取1次，考察其對提取率的影響，結果見圖2。隨著時問加長，竹筍多糖提取率逐漸增大，提取時間達到2h提取率最高，之后開始下降。由此選擇提取時間2h作為最佳提取時間進一步篩選其他因素。

2.3提取pH對長裙竹蓀多糖的影響

以不同pH提取1次，考察其對提取率的影響，結果見圖3。隨著pH升高，竹筍多糖提取率逐漸降低，提取pH為6.0時提取率最高。由此選擇提取pH=6.0作為最佳提取pH。

2.4正交試驗

根據正交試驗結果，從表2可知極差值中Rc最大為17.15，說明相比較而言pH對長裙竹蓀多糖提取率影響最大，其次是提取時間與料液比。最佳提取條件為：料液比（110：1）；提取液的PH值（5.0）；提取時間（2小時），采用此條件下提取，長裙竹蓀多糖提取率為（18.65±0.259）%。

2.5重復性與精密度實驗

按照篩選出的最優提取工藝分別提取5分樣品長裙竹蓀多糖液，測定器吸光值。5份樣品的吸光度值無顯著性差異，RSD為1.512%，表明該方法具有良好的重現性。按照篩選出的最優工藝制備長裙竹蓀多糖樣品液1份，同時取樣5次，紫外分光光度計490nm處測定其吸光度檢測精密度，結果表明5個多糖樣品液吸光度RSD為1.405%，表明本方法精密度良好。

3.討論

本實驗利用熱回流技術探索了提取長裙竹蓀多糖的方法。通過正交設計對提取料液比、時間、pH等進行了優化。結果表明pH對長裙竹蓀多糖提取具有顯著影響，最優提取工藝為：料液比110.1、時間2小時.pH5.0。同時經方法學考察本法有著良好精密度與穩定性。為長裙竹蓀多糖在化妝品中的應用提供參考。