高效凝膠色譜法測定太子參均一多糖分子量

史文濤龐文生胡　娟，2*.福建中醫藥大學藥學院，福建　福州　35022; 2.福建省中醫藥研究院，福建　福州　350003

高效凝膠色譜法測定太子參均一多糖分子量

史文濤1龐文生1胡娟1，2*
1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122; 2.福建省中醫藥研究院，福建福州350003

【摘要】目的:建立太子參均一多糖的分子量分析方法.方法:應用高效凝膠滲透色譜法，色譜柱為Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8×300mm)GPC柱，流動相為0. 1mol/L硝酸鈉溶液，柱溫35℃，示差折光檢測器(檢測器溫度35℃)，流速0. 6ml/min.結果:根據建立的方法測定，得到多糖的高效凝膠色譜圖，計算出太子參均一多糖分子量為22374Da.結論:方法準確可行，為太子參均一多糖分子量的測定提供了科學依據.

【關鍵詞】高效凝膠色譜法;太子參均一多糖;分子量

Determination of Molecular Size of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide by HPGPC

SHI Weng-tao1，PANG Weng-sheng1，HU Juan1，2*
1. FuJian University of Traditional Chinese Medicine of Pharmacy，Fuzhou 350122，China;
2. Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China

Abstract:Objective To develop a method for determining the molecular weight of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide．Methods To develop a simple High Performance Gel Permeation Chromatography(HPGPC)method，Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8×300 mm)GPC column was used with 0. 1mol/L Sodium nitrate as the mobile phase with a flow rate of 0. 6ml/min．The column temperature was maintained at 30℃and the differential refractometer detector was used(The detector temperature 35℃)．Results According to the method the molecular mass of the radix pseudostellariae polysaccharide is 22374 Da．Conclusion The method is simple，precise and has been used for the analysis of the polysaecharids from Radix pseudostellariae polysaccharide．

Key words:HPGPC; Pseudostellaria heterophylla polysaccharide; molecular weight

太子參多糖具有增強機體免疫、潤肺鎮咳、降低血糖、改善胰島素抵抗等作用，是一類重要的活性成分[1－3].多糖為單糖的天然聚合物，性質和藥理作用與其分子量大小密切相關.本課題組前期研究，不同分子量太子參多糖能夠顯著降低高脂高糖和鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠空腹血糖，改善糖耐量和胰島素耐量，其中分子量范圍約在50～210KDa的太子參多糖降糖效果最佳，且能緩解高血糖高血脂癥狀，改善胰島素抵抗[4].在此基礎上，對該分子量段太子參多糖進行分離純化，獲得均一多糖.高效凝膠色譜(HPGPC)法測定多糖的分子量，具有快速、重現性好等優點，在國內外得到了廣泛的應用[5].本文應用HPGPC方法對分離出的太子參均一多糖進行分子量測定.為太子參多糖分子量大小與藥理作用的相關性研究積累科學數據.

1　儀器與材料

1. 1儀器Waters2695高效液相系統; Waters RID2414型示差折光檢測器; Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8mm× 300mm)GPC柱.

1. 2試劑與材料太子參多糖(本課題組自制); Dextran系列葡聚糖分子量標準對照品(Pharmacia)T－2000、T－500、T－70、T－40、T－10;硝酸鈉(國藥化學試劑)，AR級;水為超純水.

2　方法與結果

2. 1色譜條件色譜柱為Waters UltrahydrogelTM1000(7. 8 ×300mm)GPC柱，流動相: 0. 1 mol/L硝酸鈉溶液;柱溫: 35℃;檢測器: Waters RID2414型示差折光檢測器(檢測器溫度35℃);流速: 0. 6 ml/min，進樣50μl.

2.2溶液的制備稱取太子參多糖適量，用流動相配成2.5 mg/ml的溶液作為供試品溶液.另取分子量已知的Dextran系列標準葡聚糖T－2000、T－500、T－70、T－40、T－10同法制成2.5 mg/ml的溶液.溶液使用前用0.45 μm微孔過濾膜過濾.

2. 3流動相的離子強度的影響本實驗分別考察了濃度為0. 05、0. 1、0. 2、0. 3mol/L的硝酸鈉溶液對太子參多糖色譜行為的影響.結果表明:當流動相的濃度較低時，洗脫能力變弱，多糖無法洗脫下來.當流動相濃度為0. 1mol/L時，出峰時間和峰面積均表現出良好的重復性，而且峰形對稱，所以最終選擇流動相的濃度為0. 1 mol/L.太子參多糖HPGPC圖譜見圖1.

2. 4樣品的濃度及進樣量的影響在最佳流動相濃度下分別考察樣品濃度1mg/ml進樣50μl，2. 5mg/ml進樣20μl，2. 5mg/ml進樣50μl.結果表明:樣品1mg/ml進樣50μl的條件下出峰時間和峰面積均表現出良好的重復性，而且峰形對稱，因此確定最佳色譜條件:流動相為0. 1mol/L硝酸鈉溶液，樣品濃度為1mg/ml，進樣50μl.

2. 5標準曲線的繪制已知分子量的標準葡聚糖溶液按上述最佳色譜條件測定，測定結果見表1.將標準葡聚糖分子量的對數logM對保留時間tR進行回歸處理，得線性回歸方程為logM =－0. 4315tR+10. 808，R2=0. 9955.

圖1　太子參多糖HPGPC色譜圖

表1　葡聚糖分子量標準對照品保留時間及其相應的對數值

2. 6樣品測定結果太子參多糖在相同色譜條件下進樣分析，HPGPC圖譜見圖1，保留時間為14. 967min，通過回歸方程計算得出太子參多糖的分子量為22374Da.

3　討論

根據以上測定結果可見，測定的太子參多糖的分子量為22374Da.本實驗建立了一種測定太子參多糖的體積排阻色譜方法，其具有簡便快捷、操作方便等優點，為太子參多糖的進一步分析提供了檢測手段.

參考文獻

[1]Wong CK，Leung KN，Fung KP．The immunoistimulating activities of antitumor polysaccharides from Pseudostellaria heterophylla[J]．Immunopharmacology，1994，28(1): 47－54．

[2]Wengsheng Pang，Siding Ling，Qiwen Dai，et al．Anti－tussive Active of Pseudostellaria heterophylla(Miq．)Pax Extracts and Improvent in Lung Function via Adjustment of Multi－Cytokine Levels[J]．Molecules，2011，16: 3360 －3370．

[3]倪受東，夏倫祝，徐先祥，等．太子參多糖對四氧嘧啶糖尿病小鼠的治療作用[J]．安徽醫藥，2010，14(5): 521－522．

[4]Juan Hu，Wengsheng Pang，Jinlong Chen，et al．Hypoglycemic effect of polysaccharides with different molecular weight of Pseudostellaria heterophylla[J]．BMC Complementary and Alternative Medicine，2013，13: 267

[5]董曉蓉．高效液相色譜法測定蔗糖鐵注射液中蔗糖鐵的分子量與分子量分布[J]．藥物鑒定，2006，15(4): 19－21．

收稿日期:( 2014. 10. 18)

通信作者:胡娟，E－mail: huj@ fjtcm. edu. cn

作者簡介:史文濤，男，在讀碩士研究生，從事中藥活性成分及質量標準研究.E－mail: 857295972@ qq. com

基金項目::國家自然科學基金資助項目(81470175).福建省中醫藥研究院自主選題資助項目2013fjzyyk－2.

【文章編號】1007－8517(2015)02－0020－02

【文獻標志碼】A

【中圖分類號】R284. 1