MB-EMBA和ASCA方法在玉米/馬鈴薯生長期根際微生物多樣性動態數據分析中的運用

毛如志，王文鵬，何霞紅　(農業生物多樣性應用技術國家工程研究中心，云南農業大學，云南昆明 650201)

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MB-EMBA和ASCA方法在玉米/馬鈴薯生長期根際微生物多樣性動態數據分析中的運用

毛如志，王文鵬，何霞紅*(農業生物多樣性應用技術國家工程研究中心，云南農業大學，云南昆明 650201)

間作模式是西南山區最重要的模式。間作對作物的效應聚焦在作物的地下部分和地上部分，其中地下部分根際微生物的多樣性及動態過程對作物的生長、產量形成具有重要貢獻，是間作生態中的重要問題。間作體系下各作物根際微生物不同時間節點多樣性的變化趨勢和關鍵因子的鑒定，對發現環境及栽培模式對土壤和根際微生物群落的動態影響重要意義。多種分子生物技術及化學分析法應用于根際微生物多樣性的分析，其中PCR-DGGE(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis)是定量和定性微生物物種多樣性的有效方法之一。Biolog ECO是定量和定性微生物活力代謝多樣性的重要方法[1-3]。深入分析環境微生物多樣性的數據結構、規律，對解釋間作效應有科學意義。PCR-DGGE和Biolog ECO采集到的根際微生物群落數據分為靜態數據及動態數據。目前，大多數研究采用靜態分析法。多元變量方法常用于DGGE 和Biolog ECO靜態數據分析[3-7]。但是，靜態分析法有無法克服的缺陷。首先，由于目前微生物的復雜性，采用的靜態分析法無法揭示微生物變化的規律及對土壤微生態的調控過程；其次，動態數據數據量大，影響因素復雜，目前的分析技術難以從數據找到相應的規律。所以，靜態多元變量分析技術無法揭示DGGE 和Biolog ECO 動態數據規律。動態數據分析法MB-EMBA(Multivariable-empirical method bayies analysis)和ASCA(ANOVA simultaneous component analysis)在生物組學研究中有少量應用。DGGE和Biolog ECO數據類似于生物組學，因此采用MB-EMBA、ASCA分析玉米與馬鈴薯間作種植模式下根際微生物多樣性的差異，從中鑒定關鍵因子，揭示環境與間作模式間的互作關系[6，8-11]。這對農業生產實踐及理解間作機理具有科學意義。

1材料與方法

1.1土壤取樣試驗設置在云南省昭通市昭陽區(1 844 m，27°48′N，103°45′E，降雨量900 mm)及魯甸縣(1 904 m，27°8′N，104°85′E，降雨量852 mm)。供玉米品種為云瑞-9409(Zeamayssubsp.Mays)；供試馬鈴薯品種為會-2(Solanumtuberosum. L)。試驗設置3個處理：①馬鈴薯凈作；②玉米馬鈴薯間作；③玉米凈作。采用五點取樣法，每點選擇10株玉米和馬鈴薯；分別在種植前、種植后85、130、160、185 d取玉米和馬鈴薯根際土壤樣品，重復3次，每個點取5份。對于用于Biolog ECO分析的土壤樣品，應以最快速度置于4 ℃冰箱保存；對于用于DGGE分析的土壤樣品，應用1.5 ml離心管裝好，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2土壤理化性質種植前，對土壤理化性質進行測試。昭通市昭陽區pH 6.38，堿解氮94 mg/kg，可溶性磷 7.8 mg/kg，可溶性鉀158 mg/kg，有機質18.2 g/kg；魯甸縣pH 5.90，堿解氮113 mg/kg，可溶性磷3.9 mg/kg，可溶性鉀118 mg/kg，有機質17.0 g/kg。

1.3田間管理不使用任何農藥進行病害防治。種植前，使用農家肥 7.5 t/hm2(pH 6.77、堿解氮2 337 mg/kg、可溶性磷7.6 mg/kg、可溶性鉀45.78 mg/kg、有機質 400 g/kg)，尿素(0.15 t/hm2)，磷(0.45 t/hm2)，鉀(0.09 t/hm2)。

1.4基質利用的評價采用Biolog ECO(Biolog.Inc.CA)平板作為基質。平板培養、數據讀取參照方法。獲得的數據選擇120 h進行多元變量分析[3]。

1.5土壤DNA的提取及PCR-DGGE土壤DNA采用百泰克試劑盒(E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)提取，操作按照試劑盒說明書進行。用濃度1.2%瓊脂糖凝膠確認DNA片段大于23 kb，OD260/2801.40～1.60，OD260/2301.5～1.60。采用Touchdown-PCR 方法進行擴譜。PCR反應體系50 μl 。其中，25 μl 2× Master Mix(生工)，21.50 μl ddH2O，0.5 μl 牛乳血清蛋白，1 μl 341F-GC(生工)，1 μl F314-5′GC(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGG-GCGGGGGCACGGGGGGCCTACG-GGAGGCAGCAG3′)，534R(5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′[2]，1 μl DNA模板。擴譜程序為94 ℃變性8 min；50～60 ℃延伸1 min，10循環；72 ℃延伸1 min，然后94 ℃變性1 min，50 ℃延伸1 min，25個循環；72 ℃延伸11 min；72 ℃保持7 min；4 ℃保存。100 μl PCR產物用Bio-Rad旋蒸儀濃縮5～6倍，Bio-Rad 的Dcode突變檢測系統灌制30%～65%梯度膠。其余過程參照Bio-Rad說明書進行。

1.6數據分析Quantity One-4.6.2 software(Bio-Rad，CA，USA)DGGE 圖譜定性，MetaboAnalyst3.0 時間序列分析[12-14]。凈作記作Type 0，間作記作Type 1，取樣次數記作0(85 d)、1(130 d)、2(165 d)、3(185 d)。MB-EMBA方法采用Hoteling-T2的數值來定量。

環境對種植方式的影響=ASCA PC1(A環境條件)- PC1(B環境條件)

2結果與分析

2.1DGGE結果分析由圖1可知，各時期及各處理條帶的亮度位置均有差異。從圖中可觀察到明顯的共有條帶，但條帶在每個時期的遷移位置不同，說明每個時期的細菌群落具有多樣性，不同時期群落結構不同。不種作物的空白對照微生物種類少，多樣性低；玉米與馬鈴薯根際微生物樣品多樣性高于對照。

2.2Biolog ECO數據MB-EMBA分析由表1可知，不同試驗點玉米單間作根際微生物在不同生育時期對碳源利用的差異明顯。與單作相比，靜安玉米間作根際微生物利用較高的碳源為D-蘋果酸、腐胺、L-蘇氨酸、酸-γ-內酯、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖酸-1，4-內酯、環糊精、苯基乙胺；魯甸間作根際微生物利用的碳源為D-蘋果酸、4-羥基苯甲酸、吐溫 40、吐溫80、丙酮酸甲酯、D-甘露醇、L-精氨酸、纖維二糖、苯基乙胺、纖維二糖、腐胺、衣康酸、D-半乳糖酸-1，4-內酯、D-半乳糖醛酸；兩試驗點間作改變根際微生物利用的碳源為D -蘋果酸、腐胺、苯基乙胺、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖酸-1，4-內酯。與單作相比，靜安馬鈴薯間作根際微生物利用較高的碳源為L-精氨酸、糖原、吐溫80、β-甲基-D-葡糖、D-蘋果酸、環糊精、 赤蘚糖醇、D-甘露醇、L-絲氨酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、衣康酸、2-丁酮酸、纖維二糖、D木糖、丙酮酸甲酯；魯甸間作根際微生物利用的碳源為α-D-乳糖、糖原、4-羥基苯甲酸、吐溫80、L-絲氨酸、D-蘋果酸、天冬酰胺、D-半乳糖醛酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖；兩實驗點間作改變根際微生物利用的碳源為赤蘚糖醇、苯基乙胺、吐溫80、L-絲氨酸、D-蘋果酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。馬鈴薯間作根際微生物利用的碳源種類多于玉米間作根際微生物利用的碳源種類。

2.3Biolog ECO和 DGGE數據的ASCA分析Biolog ECO數據ASCA分析表明，玉米單作和間作在兩個試驗點主成分1比主成分2重要，在玉米生長期1、2、3時間節點間作玉米根際微生物的活力高于單作，靜安主成分1為 45.29，魯甸主成分1為72.63，環境影響占27.34(圖2a、2b)。DGGE數據分析結果表明，在玉米生長期1、2、3時間節點，間作玉米根際微生物的活力高于單作，靜安主成分1為59.75，魯甸主成分1為56.81，環境影響占2.94(圖3e、3f)。因此，不同環境對玉米單作與間作根際微生物代謝活力大于細菌群落多樣性。馬鈴薯單作和間作在兩個試驗點。Biolog ECO數據表明，在馬鈴薯生長期，間作馬鈴薯生長旺盛時期根際微生物在不同的環境下作用相反(圖2c、2d)。DGGE數據分析結果表明，在2、3時間節點，間作馬鈴薯微生物的活力高于單作，靜安主成分1為41.47，魯甸主成分1為65.02，環境影響占23.55(圖3f、3g)。因此，不同環境對馬鈴薯單作與間作根際微生物有影響。矮桿作物馬鈴薯受到玉米、環境的影響。在不同的環境條件下，根際微生物代謝活力和細菌群落多樣性表現的趨勢不同。

表1　MB-EMBA Hoteling-T2的結果

3結論與討論

時間序列分析是一種多元變量分析，目前在生物組學數據分析中已有運用實例，主要分析生物在不同時期及環境互作下代謝組、轉錄組、蛋白組的變化規律[6，8-11]。采用時間序列(MB-EMBA、ASCA)分析DGGE和Biolog ECO動態數據，能夠從時間角度對生物規律進行研究，確定其趨勢。MB-EMBA從Biolog ECO數據中篩選出重要的碳源，但難以從DGGE數據篩選出重要的微生物類型。ASCA應用于Biolog Eco數據及DGGE數據，發現玉米凈間作根際微生物在不同生育時期對碳源利用差異明顯，馬鈴薯間作根際微生物利用的碳源種類多于玉米間作；不同環境對馬鈴薯單作與間作根際微生物有影響，矮桿作物馬鈴薯受到玉米、環境的影響，在不同的環境條件下根際微生物代謝活力和細菌群落多樣性不同。有研究表明，間作提高微生物活力及多樣性，而且缺少整個生育期的數據支持[12-19]。有的研究以生長高峰期或收獲期的樣本進行分析。另有研究以幼苗期為研究對象。這些研究缺少系統性和動態性，對于高桿作物/矮桿作物間作系統中矮桿作物生長空間、光能捕獲受到限制。這可能是微生物多樣性易受干擾的原因之一，而高桿作物捕獲更多光能、生長空間，在不同環境條件下都能增加微生物的多樣性。另一方面，時間序列(MB-EMBA、ASCA)與PLS(最小二乘法)等相關衍生方法及傳統PCA相比，對DGGE和Biolog ECO數據分析更具有優勢。PLS、PCA只能很好地解釋靜態數據包含的生物特征信息。過去的研究方法主要是采用多因數方差分析或單因數方差分析，或采用靜態數據的多元變量分析方法。分析結果只能解釋某一個生育期或環境條件下微生物的群落結構特征，無法系統地了解作物根際動態過程及微生物種群扮演的角色[3，20]。與其他方法相比，時間序列分析能全面獲取環境、栽培模式互作對根際微生物的代謝活力及種群多樣性的信息。研究表明， MB-EMBA更適合代謝群落多樣性的關鍵碳源篩選，不適合DGGE關鍵細菌多樣性的篩選。ASCA發現環境、栽培模式對根際微生物群體的影響，尤其是對DGGE和Biolog ECO的動態數據。分析結果很好地解釋間作、環境的影響，因此時間序列(MB-EMBA、ASCA)在微生態動態數據分析中具有應用價值。MB-EMBA、ASCA可作為微生物代謝群落及細菌多樣性動態數據的分析方法。微生態研究中可采用時間序列監測微生物變化動態及重要群落的篩選。在玉米與馬鈴薯間作系統中，高桿作物玉米在不同的環境下都增加微生物的多樣性，矮桿作物馬鈴薯根際微生物代謝活力和細菌群落多樣性易受環境的影響。

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摘要在農作系統中，深入分析環境、栽培模式對根際微生物多樣性的數據結構及其規律的影響，對解釋間作效應有科學意義。研究中，運用時間序列模型MB-EMBA和ASCA可以解析玉米/馬鈴薯生長期根際微生物多樣性動態數據。結果表明，MB-EMBA、ASCA可以很好地解釋環境與間作對根際微生物代謝群落及細菌物種多樣性的影響。MB-EMBA方法分析表明，對Biolog動態數據，玉米單間作根際微生物在不同生育時期對碳源利用的差異明顯，可在不同的試驗點篩選出碳源標記，馬鈴薯間作根際微生物利用的碳源種類多于玉米間作根際微生物利用的碳源種類。ASCA結果表明，高桿作物玉米單間作每個時期差異都在0.05水平顯著，在玉米生長期1、2、3時間節點間作玉米根際微生物的活力、物種多樣性高于單作，在不同環境條件下玉米單作與間作根際微生物代謝活力大于細菌群落多樣性；馬鈴薯單間作根際微生物代謝群落及細菌多樣性比較復雜，矮桿作物馬鈴薯更易受玉米、環境的影響。因此，MB-EMBA和ASCA分析可為解析生物動態數據分析提供新思路。

關鍵詞動態數據；MB-EMBA；ASCA；根際微生物代謝群落；細菌群落多樣性

Employed MB-EMB and ASCA Methods to Analyze Maize/Potato Growth Period’s Rhizosphere Microbial Biodiversity Dynamic Datas

MAO Ru-zhi, WANG Wen-peng, HE Xia-hong*(National Center for Agricultural Biodiversity, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201)

AbstractTo study the influence of environment and cultivation mode on rhizosphere microbial dynamic data structure and trends were useful in agriculture systems to explain the effects of intercropping. In this research, using time series model MB-EMBA and ASCA to analyze maize/potato growth period’s rhizosphere microbial diversity dynamic data. The results showed that MB-EMBA, ASCA could better indicated of the environment and intercropping on rhizosphere microbial metabolism community and species diversity of bacteria, MB-EMBA analysis showed, for Biolog dynamic data, maize rhizosphere microbial carbon source utilization were different with growth periods, also screened out several carbon source markers，, intercropping potato rhizosphere microbial utilization of carbon sources more than intercropping maize; ASCA results showed that maize in 1, 2, 3 time node of growth period, the activity of microbial and species diversity of intercropping maize were more than monoculture. Potato rhizosphere microbial metabolic diversity and bacteria community were more complex, easier influenced by the environment. Therefore, the analysis of MB-EMBA and ASCA provide new ideas and alternative methods to analyze biological dynamic data.

Key wordsDynamics data; MB-EMBA; ASCA; Rhizosphere microbial community metabolism; Bacterial species diversity

收稿日期2015-04-29

通訊作者

作者簡介毛如志(1986- )，男，云南昆明人，博士研究生，研究方向：土壤微生物生態。*，教授，博士，從事農業生物多樣性與作物病害控制方面的研究。。

基金項目973項目(2011CB100400)。

中圖分類號S 154.3

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-001-04