大豆GmAGL8基因的克隆及生物信息學分析

李冉陽， 秦玉濤， 張 倩， 吳 婧， 謝 皓， 郭 蓓,3*　(.北京農學院植物科學技術學院，北京 006；.北京農學院生物科學與工程學院，北京 006；3.農業部都市農業(北方)重點開放實驗室，北京 006)

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大豆GmAGL8基因的克隆及生物信息學分析

李冉陽1， 秦玉濤1， 張 倩2， 吳 婧2， 謝 皓1， 郭 蓓2,3*(1.北京農學院植物科學技術學院，北京 102206；2.北京農學院生物科學與工程學院，北京 102206；3.農業部都市農業(北方)重點開放實驗室，北京 102206)

炸莢是大豆的一種自然屬性，也是大豆生產中的一種不良現象，嚴重影響大豆收獲產量。印度學者報道，在熱帶或亞熱帶地區，大豆易炸莢品種和中度炸莢品種的產量損失分別達57～175和0～186 kg/hm2[1]，國內學者研究表明，中度炸莢品種的產量損失約為112.5 kg/hm2[2]; 相關研究者也指出野生型及小粒大豆的炸莢現象尤為普遍[3-5]。世界范圍內由于作物種皮開裂造成的農業產量損失很嚴重，因此控制種皮開裂對于提高農產品產量具有重要意義。

莢果 (pod)是由子房發育而來的果實，由通過背縫線和腹縫線相互連接的2個單心皮組成。大豆豆莢是莢果的一種。成熟的大豆莢沿著莢背縫線和腹縫線裂開，隨后散出種子的現象稱為炸莢(pod-shattering)[6]。當莢果的水分含量相對較低時，莢內生厚壁組織層細胞的張力不同，莢皮圍繞著與內生后壁組織層的纖維方向平行的軸呈螺旋的扭轉而卷曲，將連接背、腹縫線的薄壁組織拉裂，莢皮開裂[6-7]。

AGL8也被稱作AGAMOUS-like8，FRUITFULL，FUL等。前人分別對擬南芥和桃中的相關基因進行了研究。結果表明，AGL8 基因既調控分裂組織的分化，又在隨后的心皮發育中起調控作用[8-9]。根據前人研究，擬南芥FUL基因有影響擬南芥開花時間，維持花序分生組織特異性，控制花器官的發生、心皮的發育、角果的伸長等功能。在FUL眾多作用中，最受關注的是FUL控制擬南芥角果果莢開裂的作用，過表達FUL導致其成熟角果的果莢不開裂[10]。這種表型對于許多農作物特別是十字花科植物，很有借鑒意義和應用價值。徐勇等[11]從桃樹(Prunuspersica) 中克隆出與FUL同源的基因PpMADS6，研究發現，過表達的PpMADS6使擬南芥花期提前，單花器官數目增多 (如花瓣、心皮、雄蕊均有增多)，出現頂端花和多果莢角果在成熟期不開裂等性狀。且過表達的PpMADS6使擬南芥果莢不開裂，暗示它與FUL行使相同功能，控制角果裂合處細胞的木質化，影響種皮開裂[11]。

筆者對大豆GmAG48基因的克隆及生物信息學進行分析，以期能夠獲得大豆中與炸莢相關的基因。

1材料與方法

1.1試驗材料植物材料為大豆品種中黃10，由中國農業科學院作物科學研究所提供，北京農學院功能基因發掘與系統生物工程實驗室繁育。克隆載體為pUC-T(康為世紀生物科技有限公司)。大腸桿菌菌株DH5α為北京農學院功能基因發掘與系統生物工程室留存。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計。根據相關文獻報道，利用擬南芥角果開裂FUL基因及桃的PpMADS6基因，在大豆基因組中找到與之同源性高的GmAGL8基因(735 bp)。根據GmAGL8的mRNA序列，設計引物GmAGL8-F: 5′-GGAATTCCATGGGGAGAGGAAGGGTGC-3′;GmAGL8-R: 5′-GGGGTACCCCTATTCATTTGTAGGACGAAG-3′。

1.2.2目的基因的克隆。用Trizol法提取大豆中黃10的總RNA，反轉錄為cDNA，用上述引物進行PCR擴增。將擴增產物回收連接到pUC-T載體上，熱激轉化到大腸桿菌DH5α后進行序列測定。

1.2.3GmAGL8的生物信息學分析。在NCBI上將GmAGL8與其他物種進行同源性比對，使用DNAMAN構建進化樹。分析GmAGL8基因的CDS。利用ExPASy進行氨基酸分子量、等電點計算。通過ProtParam軟件，對GmAGL8基因編碼的氨基酸組成進行分析。利用Protscale在線軟件，對GmAGL8基因編碼的氨基酸序列進行親疏水性分析。

2結果與分析

2.1目的基因的克隆以大豆中黃10的cDNA為模板，以GmAGL8-F和GmAGL8-R為引物，進行PCR擴增，得到一條特異性的PCR擴增條帶，其中1、3、4號樣品條帶與預期擴增條帶(735 bp)大小一致(圖1)。選取3號PCR產物與T載體連接為GmAGL8-T并轉化大腸桿菌DH5α，通過菌落PCR鑒定出陽性克隆后進行序列測定。測序結果顯示，克隆片段與GenBank上GmAGL8序列的相似度為99.86%，在735個堿基中有734個堿基序列完全相同，只在第549 bp處產生差錯，A堿基錯配成G堿基，但翻譯產物沒有變化，仍為丙氨酸。

2.2GmAGL8的生物信息學分析

2.2.1PpMADS6和FUL與大豆GmAGL8的比對。將桃中的PpMADS6和擬南芥中的FUL分別與大豆基因組上的GmAGL8進行比對后發現，大豆中的GmAGL8序列與擬南芥中的FUL相似度為77%，與桃中的PpMADS6相似度為80%。3個基因之間的氨基酸序列同源性為74%(圖2)。研究表明PpMADS6與FUL同屬于MADS box基因家族，對果實成熟及花器官發育起著調控作用，在擬南芥中有控制角果開裂的功能，由此推測，大豆中的GmAGL8也應該與豆莢開裂有關。

2.2.2基因進化分析。將GmAGL8在NCBI中進行Blast，找到與GmAGL8具有一定相似度的序列，從中挑選出相似值較高的比對序列，利用DNAMAN軟件進行基因多重序列比對并構建進化樹，結果見圖3。從圖3可以看出，大豆與菜豆、田青、鷹嘴豆及豌豆的進化關系比較密切，其中與菜豆的相似度最高。

2.2.3GmAGL8的氨基酸序列分析。大豆GmAGL8基因的735個堿基共編碼244個氨基酸。通過ExPASy軟件對其編碼的氨基酸進行分子量及等電點分析發現，GmAGL8編碼的氨基酸等電點(pl)的理論計算值為9.21，分子量(Mw)的理論計算值為27999.95。

利用ProtParam軟件對GmAGL8基因編碼的氨基酸組成進行了分析，其中含量最高的為亮氨酸(Leu)占12.3%，其次是谷氨酸(Glu)10.2%，賴氨酸(Lys)9.0%，谷氨酰胺(Gln)和絲氨酸(Ser)均占7.4%，精氨酸(Arg)7.0%，丙氨酸(Ala)6.6%，天冬酰胺(Asn)5.3%,，蘇氨酸(Thr)和異亮氨酸(Ile)各占4.9%，甘氨酸(Gly)和纈氨酸(Val)均占4.1%，脯氨酸(Pro)3.7%，天冬氨酸(Asp)3.3%，組氨酸(His)2.5%，酪氨酸(Tyr)和蛋氨酸(Met)均占2.0%，苯丙氨酸(Phe)1.6%，含量最少的為半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)各占0.8%，不含半胱氨酸(Sec)和吡咯賴氨酸(Pyl)。負電荷總數為33，正電荷總數為39，是一種帶2個正電荷的蛋白。在原子組成方面，按所占比例依次為C∶1220、H∶2004、O∶377、N∶362、S∶7，原子總量為3 970。

2.2.4親疏水性分析。使用ExPASy的Protscale在線軟件，采用Kyte & Doolittle 算法對GmAGL8基因編碼的氨基酸序列進行親疏水性分析，結果見圖4，疏水性最大峰值出現在第45個氨基酸上，峰值為2.089。親水性最大峰值出現在第141個氨基酸上，峰值為-2.589。氨基酸在親水性區域所占比重遠大于疏水性區域，預測GmAGL8基因編碼的蛋白為親水性蛋白。

2.2.5GmAGL8的蛋白質結構。由圖5可知，GmAGL8的CDS全長為735 bp。通過對其CDS區進行分析發現，第2～79個氨基酸編碼一個與MADS具有相似功能的MEF2結構，推測其中第2～38個堿基處含有DNA結合位點，長度為37 bp；且在第59個氨基酸處還含有推測的磷酸化位點；在第21～74個氨基酸處含有多肽結合位點；在第75～167個氨基酸中間存在一個K-box基因，長度為93 bp，呈卷曲的螺旋結構，K-box與SRF-type轉錄調控有關系，很可能對多聚體的形成存在影響。

3結論與討論

根據前人研究的結果，分別在擬南芥和桃中找到了控制果莢裂合的2個基因FUL和PpMADS6。利用NCBI將這2個基因分別與大豆基因組進行比對，結果在大豆基因組中查找到一個相似性較高的基因GmAGL8，其與擬南芥FUL基因相似度為77%，與桃的PpMADS6基因相似度為80%。研究表明，FUL和PpMADS6都有控制擬南芥角果果莢開裂的作用，當該基因過表達時，擬南芥角果果莢變短且成熟時不易開裂。由此推測，大豆中的GmAGL8基因或許是控制大豆豆莢開裂與否的有效基因之一。

此外，對GmAGL8基因進行相關生物信息學分析結果表明，GmAGL8中含有一個K-box基因功能區，推斷其與多聚體的形成有關。同時發現，存在與MADS基因功能相似的MEF2。MADS-box基因家族有控制植物花器官分化、果莢裂合的功能，或許GmAGL8對大豆花和果實的發育也存在調控作用，且推斷在第2～79 bp處基因編碼的蛋白可能承擔該功能。這些推測需要后續的試驗加以證實。

通過親疏水性分析發現GmAGL8基因編碼的氨基酸多為親水性氨基酸，其中含量最高的為亮氨酸(Leu)，含量最低的為半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)，且不含半胱氨酸(Sec)和吡咯賴氨酸(Pyl)。

通過基因多重序列比對及進化樹構建發現，大豆與菜豆、田青、鷹嘴豆及豌豆的進化關系比較密切，其中與菜豆的相似度最高。

參考文獻

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摘要通過同源擴增從大豆中克隆得到與擬南芥AGL8基因相似的基因GmAGL8，并對該序列進行了測定。同時對GmAGL8進行了生物信息學分析，通過比對GmAGL8與桃PpMADS6和擬南芥FUL的核酸序列，相似度分別為80%和77%，三者的氨基酸序列同源性為74%。通過親疏水性分析預測GmAGL8基因編碼的蛋白為親水性蛋白。在GmAGL8中發現與MADS基因家族相似的MEF2并找到可能對多聚體的形成有關的K-box基因。

關鍵詞大豆；GmAGL8； 炸莢；克隆；生物信息學

Cloning and Bioinformatics Analysis of GeneGmAGL8 in Soybean

LI Ran-yang1, QIN Yu-tao1, ZHANG Qian2, GUO Bei2,3*et al(1. College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 2. College of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 3. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing 102206)

AbstractBy comparing nucleotide sequences of GmAGL8 with peach PpMADS6 and arabidopsis FUL, similarity were 80% and 77% respectively, their amino acid sequences homology of 74%. GmAGL8 gene encoding proteins is hydrophilic proteins. In soybean GmAGL8, it was found a structure named MEF2 which is similar to MADS gene families and a gene named K-box might be in the formation of polymer.

Key wordsSoybean; GmAGL8; Pod-shattering; Cloning; Bioinformatics

收稿日期2015-04-30

通訊作者

作者簡介李冉陽(1990- )，女，碩士研究生，研究方向：大豆分子遺傳育種。*，教授，從事植物分子遺傳育種研究。

基金項目國家高技術研究發展計劃(863)項目(2012AA101106)。

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-045-04