苜蓿對匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的抗性評價研究

王瑜，劉怡，周彬彬，袁慶華*，張麗,2，潘龍其,2

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070)

苜蓿對匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的抗性評價研究

王瑜1，劉怡1，周彬彬1，袁慶華1*，張麗1,2，潘龍其1,2

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070)

摘要：為探明不同紫花苜蓿品種對匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的抗性，本研究采用溫室內孢子懸浮液噴霧接種法，對來自國內外的40個苜蓿品種進行了苗期抗病性鑒定和評價，同時，對接種濃度進行研究。研究結果表明，隨著孢子懸浮液濃度的升高，10個品種匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的病情指數均呈現逐漸升高的趨勢，匍柄霉葉斑病的適宜接種濃度為1×105～1×106個孢子/mL，莖點霉葉斑病的適宜接種濃度為1×106個孢子/mL。在1×106個孢子/mL 的接種濃度下，40個苜蓿品種匍柄霉葉斑病的病情指數為3.33～35.83，莖點霉葉斑病的病情指數為13.07～52.27，品種間均存在顯著差異(P<0.05)。從中篩選出抗匍柄霉葉斑病品種14份，其中，高抗品種1份(公農2號)，中抗品種13份；從中篩選出抗莖點霉葉斑病品種1份，為來自美國的中抗品種潤布勒。

關鍵詞：紫花苜蓿；匍柄霉葉斑病；莖點霉葉斑病；抗病性

DOI：10.11686/cyxb2014337

Wang Y, Liu Y, Zhou B B, Yuan Q H, Zhang L, Pan L Q. An evaluation of the resistance of alfalfa cultivars toStemphyliumandPhomaleaf spot diseases. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(7): 155-162.

王瑜，劉怡，周彬彬，袁慶華，張麗，潘龍其. 苜蓿對匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的抗性評價研究. 草業學報, 2015, 24(7): 155-162.

http://cyxb.lzu.edu.cn

收稿日期：2014-08-20；改回日期：2014-12-25

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃課題(2011BAD17B01)和公益性行業(農業)科研專項經費項目(201303057)資助。

作者簡介：王瑜(1981-)，女，山東威海人，助理研究員。 E-mail:yuwang-99@hotmail.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail:yuanqinghua@hotmail.com

Abstract:Forty alfalfa (Medicago sativa) cultivars were collected from China and abroad and inoculated with suspensions of different concentrations of spores from Stemphylium leaf spot and Phoma leaf spot diseases to evaluate the resistance of alfalfa to these two leaf spot diseases and identify the optimal inoculation concentration. The disease indices of 10 cultivars inoculated with these two fungi gradually increased with concentration increase of the spore suspensions. The appropriate inoculation concentrations for comparing cultivar resistance to Stemphylium and Phoma were 1×105to 1×106spores per milliliter and 1×106spores per milliliter, respectively. With a concentration of 1×106spores per milliliter in the inoculate, the disease indices of Stemphylium leaf spot in forty cultivars ranged from 3.33 to 35.83, while the disease indices of Phoma leaf spot ranged from 13.07 to 52.27. There were significant differences between the 40 cultivars (P<0.05). Fourteen cultivars were found to be resistant to Stemphylium leaf spot, including one highly-resistant cultivar-Gongnong No.2 and thirteen moderately-resistant cultivars. Only one cultivar, Rambler, from America was found to have moderate resistance to Phoma leaf spot.

An evaluation of the resistance of alfalfa cultivars toStemphyliumandPhomaleaf spot diseases

WANG Yu1, LIU Yi1, ZHOU Bin-Bin1, YUAN Qing-Hua1*, ZHANG Li1,2, PAN Long-Qi1,2

1.InstituteofAnimalScienceofCAAS,Beijing100193,China; 2.CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Key words: alfalfa (Medicagosativa);Stemphyliumleaf spot;Phomaleaf spot; disease resistance

紫花苜蓿(Medicagosativa)是全世界最重要的豆科牧草，因其具有品質優良、適口性好、飼用形式多樣、飼用價值高和良好的生態效應，被冠以“牧草之王”的美稱[1-3]。近年來，隨著我國苜蓿種植面積的進一步擴大，苜蓿病害問題也日趨嚴重，已成為制約苜蓿產業發展的重要因素之一[4]。其中，苜蓿葉部病害是引起草場退化、草產量減少、草產品質量下降的重要原因[5]。苜蓿匍柄霉葉斑病(Stemphyliumleaf spot)又稱苜蓿輪斑病，是由匍柄霉(Stemphyliumbotryosum)引起的葉部病害。該病廣泛發生于美國、澳大利亞、新西蘭等國家，在我國的華北、東北與西北等苜蓿主產區也有該病發生的記錄，已同銹病、霜霉病、褐斑病并列為中國普遍發生、危害較重的葉部病害[6-9]。匍柄霉葉斑病發生嚴重時會導致葉片大量脫落，莢果生長期縮短，種子產量降低50%，葉片中香豆醇含量顯著增高[10]。

苜蓿莖點霉葉斑病又稱春季黑莖與葉斑病(spring black stem and leaf spot)，是由苜蓿莖點霉(Phomamedicaginisvar.medicaginis)引起的葉部病害。該病是一種廣泛發生的世界性病害，在我國的吉林、甘肅、內蒙古、河北、陜西等地均有發現[11-12]。苜蓿莖點霉葉斑病發生嚴重時使苜蓿干草產量減產40%～50%，種子產量減產30%，在生長季中期和后期，此病常發生非常嚴重，對許多大葉型品種(如新疆的和闐苜蓿、沙灣苜蓿、布爾津苜蓿，以及從美國和蘇聯引進的許多品種)危害很大，株發病率可高達80%～100%[11]。

選用抗病品種是苜蓿病害防治最為經濟有效的方法，對苜蓿霜霉病[13]與褐斑病[14]等葉部病害，國內已有研究者進行了抗病種質材料篩選研究。對匍柄霉葉斑病[6,15-16]與莖點霉葉斑病[17]國外已有研究者針對國外苜蓿品種進行了抗病性鑒定與評價，國內則僅有研究者進行了匍柄霉葉斑病[18-19]的抗病性評價，針對莖點霉葉斑病的抗性評價鑒定尚無報道。本研究通過溫室內孢子懸浮液噴霧接種法，對來自國內外的40個苜蓿品種分別進行匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的抗病性鑒定與評價，以篩選抗病品種，為我國苜蓿種植中抗病品種的選擇與抗病育種提供參考依據。

1材料與方法

1.1　供試材料

苜蓿品種：本試驗所用40個苜蓿品種(表1)由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牧草種質資源研究室提供，其中，來自國外的品種24個，來自國內的品種16個。

供試菌株：匍柄霉與苜蓿莖點霉菌種分別采自內蒙古阿魯科爾沁旗田園牧歌草業公司生產基地與吉林農業科學院試驗基地，經室內分離純化擴繁及致病性鑒定后，接種于 PDA培養基上，4℃保存備用。

1.2　研究方法

1.2.1育苗試驗于2014年3-8月在中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所廊坊基地進行。將苜蓿種子用0.1% 升汞消毒3～5 min，無菌水沖洗4次，之后放在消毒培養皿的濾紙上，加適量滅菌水以保持種子吸水膨脹。將培養皿放入20℃培養箱內，待種子發芽至幼根長到1 cm長時移植到裝有滅菌草炭與壤土(1∶1)的塑料盤中，塑料盤規格為60 cm×45 cm×15 cm(長×寬×高)。移植時，每個塑料盤劃分為10行，每行種植1個品種(10株/行)，每品種3個重復，25℃溫室內培養6周后進行接種。

1.2.2接種方法采用孢子懸浮液噴霧接種法。分別配制濃度為1×107，1×106和1×105個孢子/mL的分生孢子懸浮液，在2 h內用喉頭噴霧器將其均勻噴灑在苜蓿葉片上，每盤用量為40 mL，覆蓋黑色塑料薄膜以確保100%相對空氣濕度，23℃黑暗保濕24 h，之后移去塑料薄膜，25℃溫室內正常管理。12 d后進行病情調查。

隨機選擇4(阿伯羅Ⅱ)、8(定襄)、12(呼圖壁)、16(雷西斯)、20(南特)、24(切羅克)、28(泰安)、32(焉耆)、36(印第安)、40(費納爾)等10個品種進行3個濃度孢子懸浮液噴霧接種，根據病情指數篩選適宜的接種濃度。之后，利用篩選出的適宜接種濃度對40份材料進行接種。

1.2.3病情調查對每株苜蓿每個葉片的病情級別進行調查，根據小葉病斑占葉面積的百分比對葉片進行病害分級。

匍柄霉葉斑病的分級標準為，0級：無病斑；1級：小葉病斑面積占葉面積的1%~5%；2級：小葉病斑面積占葉面積的5%~15%；3級：小葉病斑面積占葉面積的15%~25%；4級：小葉病斑面積占葉面積的25%以上。

莖點霉葉斑病的分級標準為，0級：無病斑；1級：小葉病斑占葉面積的1%~5%；2 級：小葉病斑占葉面積的5%~15%；3 級：小葉病斑占葉面積的15%~25%；4 級：小葉病斑占葉面積的25%~35%；5 級：小葉病斑占葉面積的35%以上。

計算各品種的發病率和病情指數，每品種3次重復，每重復統計10株。

發病率(%)=(病株數/總株數)×100

1.2.4抗病級別劃分根據各品種苜蓿的病情指數分別對匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的抗病級別進行劃分，分級標準為：病情指數<5為高抗；5≤病情指數≤15為中抗；15<病情指數≤25為中感；病情指數>25為高感。

1.3　數據處理

利用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析，用Duncan法進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1　孢子懸浮液濃度的篩選

3個孢子懸浮液濃度下，10個品種間匍柄霉葉斑病的病情指數均存在顯著差異(P<0.05)，隨著孢子懸浮液濃度的升高，各品種的病情指數均呈現升高的趨勢(圖1)。當孢子懸浮液濃度為1×105個孢子/mL時，10個品種匍柄霉葉斑病的病情指數為4.67～28.33；當孢子懸浮液濃度為1×106個孢子/mL 時，病情指數為7.50～35.83；當孢子懸浮液濃度為1×107個孢子/mL 時，病情指數為36.67～66.67，該濃度下10個品種的病情指數普遍較高，均表現為高度感病，不利于區分抗感材料。因此，1×105～1×106個孢子/mL 為匍柄霉葉斑病適宜的接種濃度，本試驗后期采用1×106個孢子/mL。

圖1　匍柄霉孢子懸浮液不同接種濃度對10個苜蓿品種病情指數的影響Fig.1　Effect of different inoculation concentration of S. botryosum spores suspension on disease index of ten alfalfa cultivars　同一孢子懸浮液濃度下的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters under the same spores concentration show significant differences (P<0.05). The same below.

隨著孢子懸浮液濃度的升高，各品種莖點霉葉斑病的病情指數也呈現升高的趨勢(圖2)。當孢子懸浮液濃度為1×105個孢子/mL時，10個品種莖點霉葉斑病的病情指數為14.93～21.33，各材料間無顯著差異；當孢子懸浮液濃度為1×106個孢子/mL時，病情指數為20.00～39.20，材料間存在顯著差異(P<0.05)；當孢子懸浮液濃度為1×107個孢子/mL時， 病情指數為30.67～66.13，材料間也存在顯著差異(P<0.05)， 但該濃度下10個品種的病情指數也普遍較高，均表現為高度感病，不利于區分抗感材料。因此，莖點霉葉斑病的適宜接種濃度為1×106個孢子/mL。

表1　苜蓿品種及來源

注：FAO為聯合國糧食及農業組織的簡稱。

圖2　莖點霉孢子懸浮液不同接種濃度對10個苜蓿品種病情指數的影響Fig.2　Effect of different inoculation concentration of P. medicaginis var. medicaginis spores suspension on disease index of ten alfalfa cultivars

Note: FAO is the abbreviation of Food and Agriculture Organization.

2.2　對匍柄霉葉斑病的抗病性

40份材料間匍柄霉葉斑病的病情指數存在顯著差異(P<0.05)，發病率亦存在顯著差異(P<0.05)(表2)。病情指數的變化范圍為3.33～35.83，發病率的變化范圍為13.33%～96.67%，表明不同品種苜蓿材料對匍柄霉葉斑病的抗性存在較大差異。根據頻率分布圖(圖3)可知，病情指數小于5的高抗材料有1份；病情指數為5～15的中抗材料有13份；病情指數為15～25的中感材料有14份；病情指數大于25的高感材料有12份。由此可見，40份材料中，只有2.5%(1份)的材料為高抗材料，有32.5%(13份)的材料為中抗材料，其余65.0%(26份)均為感病材料。高抗匍柄霉葉斑病材料為來自陜西的公農2號。

圖3　40個苜蓿品種匍柄霉與莖點霉葉斑病病情指數的頻率分布Fig.3　Distribution of disease index of Stemphylium and Phoma leaf spot in forty alfalfa cultivars

表2　40個苜蓿品種匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的病情分級

HR: 高抗High resistance; MR: 中抗Medium resistance; HS: 高感High susceptibility; MS: 中感Medium susceptibility.

2.3　對莖點霉葉斑病的抗病性

40份材料間莖點霉葉斑病的病情指數存在顯著差異(P<0.05)(表2)，發病率均為100%,無差異。病情指數的變化范圍為13.07～52.27，表明不同品種苜蓿材料對莖點霉葉斑病的抗性也存在較大差異。根據頻率分布圖(圖3)可知，病情指數小于5的高抗材料有0份；病情指數為5～15的中抗材料有1份；病情指數為15～25的中感材料有14份；病情指數大于25的高感材料有25份。由此可見，40份材料中無高抗材料，只有2.5%(1份)的材料為中抗材料，其余97.5%(39份)均為感病材料。中抗莖點霉葉斑病材料為來自美國的潤布勒。

3討論與結論

3.1　接種濃度

北美苜蓿協會(NAAIC)于1991年曾提出苜蓿品種對匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病抗病性的測定標準，包括苜蓿幼苗培養、菌株培養、接種方法與條件、病害分級等方面(http://www.naaic.org/stdtests)。其中，菌液濃度的高低是接種成敗的關鍵，各種病害接種評價中使用的菌液濃度不盡相同。在NAAIC的標準中，匍柄霉葉斑病的建議濃度為1×104～5×104個孢子/mL，莖點霉葉斑病的建議濃度為1×106～4×106個孢子/mL。

在本研究的匍柄霉葉斑病接種鑒定中，當孢子懸浮液濃度為1×105～1×106個孢子/mL時，10個品種的病情指數為4.67～45.83，材料間存在顯著差異，可以區分抗感材料，為適宜的接種濃度。當孢子懸浮液濃度為1×107個孢子/mL時，10份材料的病情指數普遍偏高，均表現為高度感病，不利于區分抗感材料，且浪費菌源。張靜妮[18]在對苜蓿進行匍柄霉葉斑病接種鑒定的過程中發現,5×105～1×106個孢子/mL為適宜的接種濃度，本研究的結果與此基本一致。

在莖點霉葉斑病的接種鑒定中，當孢子懸浮液濃度為1×105個孢子/mL時，10個品種的病情指數間無顯著差異；當孢子懸浮液濃度為1×106與1×107個孢子/mL時，10個品種間均存在顯著差異(P<0.05)，但在1×107個孢子/mL濃度時，10個品種的病情指數普遍較高，均表現為高度感病，不利于區分抗感材料。因此，莖點霉葉斑病的適宜接種濃度為1×106個孢子/mL，與NAAIC建議的濃度一致，另外，Castell-Miller等[17]研究莖點霉在抗感紫花苜蓿種質材料植株內的侵染與擴展時所采用的接種濃度為1.2×106～1.6×106個孢子/mL，本研究的結果與此也基本一致。

3.2　抗病品種篩選

本研究從40份苜蓿種質材料中篩選出高抗匍柄霉葉斑病材料1份，為來自陜西的公農2號，中抗材料13份(5份國內材料，8份國外材料)，中感材料14份(4份國內材料，10份國外材料)，高感材料12份(6份國內材料，6份國外材料)。其中，來自國內的16份材料中，高抗材料占 6.25%，中抗材料占31.25%，中感材料占25.0%，高感材料占37.5%；來自國外的24份材料中，高抗材料占0%，中抗材料占33.33%，中感材料占41.67%，高感材料占25.00%。表現為抗病的14份材料分別為：公農2號，C/W5，阿羅特，定襄，阜康，蘭格勒，羅佑瑪，帕拉維沃，潤布勒，渃瓦，維勒，興平，焉耆，沂陽。Borges等[15]通過對不同苜蓿屬匍柄霉葉斑病抗性的研究發現Medicagocancellata，野苜蓿(M.falcata)，M.coerulea和M.hemicycla等4個苜蓿屬均高抗匍柄霉葉斑病，而紫花苜蓿則均表現為感病。Lucas等[16]曾于1973年通過田間與室內的接種鑒定，從4個紫花苜蓿品種中篩選出Apalachee具有較好的匍柄霉葉斑病抗性。國內的研究者中，張靜妮[18]通過對50個紫花苜蓿品種的室內接種鑒定篩選出抗匍柄霉葉斑病品種3個，分別為公農1號，慶陽，BL-201(品系)。黃寧[19]則通過對44個品種的離體葉接種鑒定篩選出公農2號、BL-201(品系)等15個高抗品種。本研究中公農2號也表現為高抗，與黃寧[19]的研究結果一致，表明試驗結果可靠，可將其作為匍柄霉葉斑病抗病種質資源加以發掘利用。

經莖點霉接種鑒定發現40份紫花苜蓿種質材料的發病率均為100%，所有植株均呈現不同程度的染病狀態，病情指數為13.07～52.27。從40份材料中篩選出中抗材料1份，為來自美國的潤布勒，中感材料14份(7份國內材料，7份國外材料)，高感材料25份(9份國內材料，16份國外材料)。其中，來自國內的16份材料均表現為感病，中感材料占43.75%，高感材料占56.25%；來自國外的24份材料中，中抗材料占4.16%，中感材料占29.17%，高感材料占66.67%。綜合而言，只有來自美國的潤布勒具莖點霉中等抗性，其余材料均表現為感病。NAAIC公布的莖點霉葉斑病抗病對照品種為“PL-PhR”和“Ramsey”，感病對照品種為“Ranger”和“Lahontan”。

品種的抗病性除取決于自身外,還受各種因素的影響，因此,在通過溫室試驗篩選得到抗病品種后，還需要在后期進行大田自然環境下的跟蹤試驗[20]。

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