不同放牧強度下垂穗披堿草遺傳多樣性分析

陳釗,梁新平,侯扶江，田苗苗，張紅瑞，余瑩，管永卓，王成章，嚴學兵*

(1.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002； 2.蘭州大學草地農業科技學院，草地農業生態系統國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

不同放牧強度下垂穗披堿草遺傳多樣性分析

陳釗1,梁新平1,侯扶江2，田苗苗1，張紅瑞1，余瑩1，管永卓1，王成章1，嚴學兵1*

(1.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002； 2.蘭州大學草地農業科技學院，草地農業生態系統國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

摘要：放牧對草地植物種群遺傳與進化產生重要影響，本研究利用SSR分子標記對4個不同放牧強度下垂穗披堿草種群遺傳多樣性進行研究，試驗地選擇在甘肅省甘南自治州瑪曲縣的阿孜試驗站，利用8對多態性強的SSR引物對不同放牧壓力下4個居群的800個個體基因組進行檢測，每個位點的有效等位基因數在1.2267～1.9976之間。利用popgene分析發現不放牧垂穗披堿草種群遺傳多樣性最高，在3種不同放牧地，中等放牧強度的遺傳多樣性指數較高，其次為重牧，最后為輕度放牧。在不同放牧干擾下的4個垂穗披堿草種群的遺傳分化系數為0.5168，基因流Nm=0.2337，說明4個種群的遺傳變異主要發生在種群之間。從種質資源保護角度來講，不放牧對于垂穗披堿草種質資源的保護是有利的；從草地利用角度，中等放牧強度比較合理。

關鍵詞：遺傳多樣性；基因流；放牧強度；SSR；披堿草

DOI：10.11686/cyxb2014355http://cyxb.lzu.edu.cn

陳釗,梁新平,侯扶江，田苗苗，張紅瑞，余瑩，管永卓，王成章，嚴學兵. 不同放牧強度下垂穗披堿草遺傳多樣性分析. 草業學報, 2015, 24(8): 159-165.

Chen Z, Liang X P, Hou F J, Tian M M, Zhang H R, Yu Y, Guan Y Z, Wang C Z, Yan X B. Genetic diversity ofElymusnutansunder different grazing intensities. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 159-165.

收稿日期：2014-08-21；改回日期：2014-12-01

基金項目：國家自然科學基金項目(30901051,31172249)資助。

作者簡介：陳釗(1990-)，男，河南滑縣人，碩士。E-mail:740515547@qq.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail:yxbbjzz@163.com

Genetic diversity ofElymusnutansunder different grazing intensities

CHEN Zhao1, LIANG Xin-Ping1, HOU Fu-Jiang2, TIAN Miao-Miao1, ZHANG Hong-Rui1, YU Ying1, GUAN Yong-Zhuo1, WANG Cheng-Zhang1, YAN Xue-Bing1*

1.CollegeofAnimal&VeterinaryScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China; 2.CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,Lanzhou730020,China

Abstract:Grazing can influence the population genetics and evolution of grassland plant species. To study the relationship between grazing and the potential for evolutionary differentiation and gene flow, we used SSR markers to study the genetic diversity of Elymus nutans. The experiment station investigated is based at Azi, in Maqu County in the Gannan region of Gansu Province. The grazing lands were divided into four levels according to different grazing intensities. Eight pairs of SSR primers were used to detect genetic diversity among 800 individual plants from the four populations under different grazing pressures. The effective number of alleles per locus ranged from 1.2267 to 1.9976. We found that materials under moderate grazing intensity had the highest genetic diversity index, followed by the heavy and then light grazing levels. The genetic differentiation coefficient under different grazing levels is 0.5168. This suggests that genetic variation of the four populations exists mainly among populations. In conclusion, no grazing or enclosure is effective for the conservation of E. nutans genetic resources. For grassland utilization, however, moderate grazing is relatively optimal.

Key words:genetic diversity; gene flow; grazing intensity; SSR; Elymus

草地生態系統是我國最大的綠色屏障，是生態環境的基礎，草地對于維護生態平衡，改善生態環境，以及保護人類生存和發展都起著至關重要的作用[1]。我國草地面積占國土總面積的42%，達到4億hm2。其中可利用的大約為3億hm2，占國土總面積的1/3。但是近年來由于人們對草原不合理的開發和利用，導致我國草原已經出現了不同程度的退化。其中，不合理的放牧是導致草原退化的主要原因[2]。在相同的氣候條件下，放牧干擾因子對草原植物的影響可以超越不同地段其他環境條件的影響，成為影響草原植物群落關系主要影響因子[3]。在放牧過程中，家畜可以通過選擇性采食，直接影響某些甚至是某一類植物的種群結構，從而影響或者改變群落結構[4]。放牧強度還會影響到牧區土壤理化性質和土壤熱量的流動[5]。改變草地群落組成，草地初級生產力并非隨著放牧強度的增加而線性下降[6]。適當的放牧會對草地造成正面的干擾可促進草地物種多樣性，加強草地的生產力和群落的穩定性[7]。物種多樣性是地球上生物賴以生存的基礎，是生物可以適應不同的環境，不斷進化和繁衍的物質基礎。種群的遺傳多樣性與種群的進化潛力和對環境的適應性有著密切的聯系。遺傳多樣性是地球上物種多樣性的核心和物質基礎，也是生物多樣性的重要組成部分，更是地球生態系統中各種群落之間可以不斷進行物質循環和能量流動的核心。現有的研究多集中在個體和種群水平上的種群動態和物種功能特征，以及在群落水平上的結構及系統功能的影響[8-9]。研究物種的遺傳多樣性可以從分子角度對物種的種群變化進行深入的探討。

遺傳多樣性的研究伴隨著分子化學、分子遺傳學等學科的迅速發展，科學家可以從不同的層次、不同的角度用不同的技術對物種的遺傳信息和生物性狀進行研究和推測。近年來分子標記是較為常見的一種方法。SSR(simple sequence repeat，簡單序列重復)標記以其多態性高，操作方便，數量豐富和穩定性強等眾多優點成為一種較為理想的分子標記方法。SSR在基因組中較為均勻地分布，容易檢測，在實驗操作過程中進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)擴增時對模板DNA的要求不高，只要有少量的DNA模板就能進行高通量的分析[10]。目前，國內外學者已經將DNA分子標記技術應用在了多花黑麥草等牧草育種工作中[11]。可以用來揭示居群之間、品種之間或是個體之間遺傳的多樣性，重復性較好，近年來逐漸取代了RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性內切酶片段長度多態性)，ISSR(inter-simple sequence repeat，簡單重復序列區間擴增多態)等分子標記[12]。

垂穗披堿草 (Elymusnutans)主要分布于我國寧夏，甘肅，新疆，內蒙古等省區，抗寒性強，粗蛋白含量較高，屬于多年生疏叢型優質牧草[13-14]，是草地群落系統的重要組成部分，有著重要的經濟價值和生態意義。本實驗主要利用分子標記的手段通過對不同放牧強度下垂穗披堿草種群遺傳多樣性的研究來深入了解放牧與種群進化潛力，分化程度及基因流動的關系。為確定合理有效的放牧方式及治理高寒草地的退化提供一定的依據。

1材料與方法

1.1　試驗地概況及設計

本試驗是在甘肅省甘南自治州瑪曲縣的阿孜試驗站進行。瑪曲縣位于黃河上游，甘肅、四川和青海三省的結合部，在青藏高原的東北緣。并位于33°06′30″-34°30′15″ N，100°45′45″—102°29′00″ E，海拔3500 m左右。是黃河中下游地區的天然自然屏障[15]，年降水量約為620 mm，全年的平均日照時數為2580 h，1月溫度最低是-8.7℃，7月溫度達到最高是11.3℃。年均溫僅為1.2℃，≥10℃積溫持續時期僅有2個月多，此地屬于典型高原大陸性氣候。植被屬于高寒草原類型，全縣的草地類型為高寒草甸草地和山地草甸草地[16]。根據放牧強度的不同，4個草場進行不同強度放牧處理已達3年，把放牧地分為4種強度的放牧地：封育草地不進行放牧作為對照(control，CK)，放牧強度為4只羊/hm2是輕度放牧(light grazing，LG)，放牧強度為8只羊/hm2是中度放牧(medium grazing，MG)，放牧強度為16只羊/hm2是重度放牧(high grazing，HG)，輪牧周期是45 d，放牧期是7 d左右。在每一個放牧小區隨機采收成熟的種子穗80個(實驗種植40株)，單株的植物距離不小于5 m(防止采集到同一植株不同個體即克隆單株)，每一個種子穗放入一個信封中標記，在烘箱中50℃烘干(防止部分種子過潮不利于攜帶)帶回實驗室。

1.2　實驗方法

將垂穗披堿草種子在烘箱中50~55℃的溫度處理，大約5~6 d的時間以打破種子的休眠作用。然后將種子種在一次性花盆中，澆水，在未發芽前以光照25℃18 h，黑暗20℃6 h用光照培養箱培養，種子發芽后以光照26℃12 h，黑暗20℃12 h進行培養。幼苗在1個月左右時即可長至兩葉一心，此時的幼苗就可以用于DNA的提取。

表1　本研究中所用SSR引物序列

本實驗提取垂穗披堿草的基因組用的是經過改進后的CTAB(cetyltriethy lammoniurn bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法[17]，通過分光光度計和瓊脂糖跑膠來鑒別提取基因組的純度。將提取的基因組進行PCR反映，PCR體系為20 μL體系。模板為1 μL，引物各1 μL，ddH2O為7 μL，mix為10 μL[10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，250 μmol/L DNTP，0.05 U/μL Polymerase]。PCR反應程序為94℃預變性4 min，94℃變性30 s，退火溫度在50~55℃之間40 s，72℃延伸30 s，72℃延伸10 min，循環數為36。本實驗引物具體信息如表1和表2。將PCR擴增產物首先用1%瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR擴增產物存在，然后再用6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。

1.3　數據分析

經過銀染后的聚丙烯酰胺膠可以直接在觀片燈下讀取，SSR是共顯性標記，可以根據條帶的類型直接讀出基因型為雜合或者是純合，基因類型用AA，BB，AB來標記，形成原始數據，每一對等位基因視為一個多態性位點(圖1)。遺傳多樣性指數(有效等位基因[18]、Shannon’s信息指數[19]、有效種群大小、Nei’s指數)及基因流[Nm=Gene flow estimated from Fst=0.25(1-Fst)/Fst]采用Popgene V.1.32進行分析。

表2　SSR-PCR位點遺傳多態性

圖1　部分垂穗披堿草LG組SSR-PCR擴增結果Fig.1　PACG gel with results of SSR-PCR bands from LG in different Elymus populations

2結果與分析

2.1　SSR-PCR擴增位點遺傳多樣性分析

種群遺傳多樣性的研究，通常是以Shannon信息指數，有效等位基因數等來衡量其水平。本研究通過SSR-PCR的引物篩選試驗，挑選出的8對引物共擴增出16個位點，引物ECGT36對應A-1到A-3，EAGA104對應L-1到L-3，ECGA114對應AA-1和AA-2，ECGA22對應F-1和F-2，EAGA101對應M-1，EAGA13對應G-1和G-2，EAGA103對應N-1，EAGA104對應K-1和K-2。每對引物檢測出的位點數不同，其中引物ECGT36，EAGA104擴增出的位點最多，檢測到3個位點；EAGA101和EAGA103擴增出的位點最少，檢測到1個位點(圖1)。所有位點的多態性均為100%，說明實驗材料的遺傳多態性較為豐富。擴增片段的長度在370~1598 bp之間，位點EAGA101的M-1擴增片段最大為1598 bp，AA-2(ECGA114)擴增片段最小為370 bp。利用8對SSR引物對不同放牧壓力下4個居群的800個個體遺傳多樣性進行檢測，每個位點的有效等位基因數在1.2267~1.9976之間，其中位點AA-1的有效等位基因數最高是2.0000，最低的是K-2，為1.0398(表2)。

2.2　遺傳多樣性分析

在不同放牧壓力下的4個垂穗披堿草居群通過SSR-PCR擴增出條帶的多態性隨著放牧壓力的增大呈下降的趨勢，對照組的多態性最高為100%，在重度放牧干擾下的垂穗披堿草的位點多態性比率為43.75%，是4個居群中最低的一組。有效等位基因數(Ne)，Nei’s遺傳多樣性(H)和Shannon信息指數(I)表現出一致性，在不放牧條件下均表現出最高的趨勢，Ne是1.7100，H是0.3919，I是0.5702。在放牧條件下，中度放牧干擾下垂穗披堿草的Shannon信息指數及有效等位基因數最高，即在中度放牧條件干擾下的垂穗披堿草種群的進化潛力及基因的多樣性都是最高。輕度放牧的有效等位基因數和Shannon信息指數是最低的(表3)。與對照組相比，LG組，MG組和HG組的Nei’s遺傳多樣性(H)和Shannon信息指數(I)分別降低了42.3%，22.0%，23.8%，37.7%，18.6% 和19.4%。在放牧地中，中等放牧強度的遺傳多樣性指數較高，其次為重牧，最后為輕度放牧。這說明放牧干擾會明顯地影響到垂穗披堿草的遺傳多樣性，對于垂穗披堿草的進化和生存有著較大的干擾作用。不放牧條件下有利于垂穗披堿草遺傳多樣性的維持，在草地放牧條件下，中度放牧對于維持垂穗披堿草的遺傳多樣性是最有利的。

2.3　遺傳相似性和遺傳距離的分析

不同居群間的遺傳距離和遺傳相似性可以反映出各居群間的親緣關系以及遺傳背景的差異性，遺傳距離和遺傳相似性呈負相關性，遺傳距離越大，說明居群間的親緣關系越遠，遺傳相似性也就越低，反之亦然。由表4可以看出，中度放牧區和輕度放牧區的遺傳相似度最大，為0.7901，重度放牧和中度放牧的遺傳相似性最小，為0.5244。輕度放牧和對照組的遺傳相似度是0.7446，重度放牧和對照組的遺傳相似度是0.6913，重度放牧和輕度放牧的遺傳相似系數是0.5965。重度放牧和對照組的遺傳相似度是0.5544。

在不同放牧強度干擾下的垂穗披堿草，重度放牧和中度放牧的遺傳距離最大，為0.6456，輕度放牧和中度放牧的遺傳距離最小,為0.2356，對照組與輕度放牧的遺傳距離是0.2949，對照組與中度放牧的遺傳距離是0.3691，對照組與重度放牧組的遺傳距離是0.5899，輕度放牧組與重度放牧組的遺傳距離是0.5166。

根據遺傳距離，對不同放牧壓力下的垂穗披堿草材料的SSR數據進行聚類分析，構建了垂穗披堿草的UPGMA系統樹(圖2)。從聚類分析圖上可以看出，輕度放牧和中度放牧先聚為一類，然后與對照組聚為一類，最后與重度放牧聚為一類。

表3　不同放牧條件下垂穗披堿草的遺傳多樣性指數

表4　不同放牧強度干擾下垂穗披堿草種群

圖2　不同放牧條件種群的聚類分析Fig.2　Clustering of populations under different grazing intensity

上三角為Nei’s遺傳相似性，下三角為Nei’s遺傳距離。Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance(below diagonal). 2.4遺傳分化系數和基因流分析

不同放牧壓力下的4個垂穗披堿草種群間的遺傳分化系數Fst為51.68%，不同居群總的遺傳分化系數為0.4018，種群間的基因流為0.2337(表5)。說明種群間的基因流較小，即種群間的遺傳變異較大。不同居群的遺傳分化有51.68%發生在種群之間，本實驗的結果符合垂穗披堿草是自花授粉植物的特質。Nei[20]認為：自花授粉的植物種群間的基因流Nm<1。

3討論

不同放牧強度下垂穗披堿草種群的遺傳多樣性結果表明，在放牧條件下，中度放牧干擾下種群遺傳多樣性最高，其次是重度放牧，輕度放牧條件下種群的遺傳多樣性最低。物種遺傳多樣性的高低可以反映該物種或種群對環境的適應能力以及本身的進化

表5　處理組間的遺傳分化系數與基因流

潛力和該種群的穩定性。物種的遺傳多樣性越高，其對環境變化的適應性就越強[21]。這一結果與前人的研究結果較為相似[22-23]，蒙旭輝等[22]的研究表明在中度放牧條件下放牧群落的多樣性指數要顯著地高于其他放牧干擾群落，中度放牧強度最為適宜草地群落類型。殷國梅等[24]的研究表明在不同的放牧強度干擾下，適度放牧可以使群落保持較高的密度和蓋度，群落較為穩定，既可保證草地有一定的載畜量，又可以保持草地群落的穩定性。本實驗結果說明放牧干擾對種群的遺傳多樣性有著明顯的影響并且在中度放牧條件下有利于維持物種的進化潛力和穩定性。這一結果也符合“中度干擾理論”[24-25]。原因可能是由于在重度放牧條件下，家畜的反復啃食會嚴重影響垂穗披堿草植株的正常生長，植物本身不能進行正常的開花，結果，導致植物個體間及種群內的基因流動較小。放牧強度的差異進而導致群落中優勢種群的地位發生逐漸的變化[26]。而在輕度放牧條件下，由于牲畜的選擇性采食可能會降低垂穗披堿草在群落中的地位，群落中不同物種的競爭壓力影響到垂穗披堿草本身的遺傳多樣性。輕牧條件下，家畜攜帶種子造成的基因流動較小，導致輕度放牧的遺傳多樣性最低。對照組的遺傳多樣性最高這一結果可能與試驗地本身的封育時間有關。適宜的放牧強度能夠維持較高的地上生物量。不同強度的放牧干擾對物種多樣性的影響不同，適度放牧可以增加群落的多樣性， 而長期的過度放牧或者完全不放牧都將導致群落多樣性降低[27]。

本研究的4個在不同放牧強度干擾條件下的垂穗披堿草種群的遺傳分化系數為51.68%，基因流Nm=0.2337，說明4個種群的遺傳變異主要發生在種群之間。基因流較小，說明4個種群間很少發生基因流動，這一方面可能與垂穗披堿草本身是自花授粉有關。種群之間很難通過花粉傳播發生基因流動。另一方面也說明放牧干擾可以明顯地影響到植物種群的遺傳變化，基因流是影響自然植物種群間遺傳變異的關鍵因素。種群間高的基因流可以降低物種的遺傳分化并保持其完整性。在植物種群中，基因流一般通過種子或花粉進行傳播，適量基因流可以有效地促進居群地方性適應以及多樣化[28]。本實驗中的基因流較低, 低水平的基因流可以促進居群對環境的適應性，進而造成種群之間的遺傳分化。高水平的基因流可以防止居群的分化。

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