超高效液相色譜測(cè)定豬肉中喹乙醇的殘留量

劉　淳

(北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心 ，北京 100009)

?

超高效液相色譜測(cè)定豬肉中喹乙醇的殘留量

劉淳

(北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心 ，北京 100009)

摘要：建立了超高效液相色譜測(cè)定豬肉中喹乙醇的方法。樣品溫水提取，用亞鐵氯化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白，超高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定。色譜柱BEH C181.7μm× 50mm×2.1mm，用不同體積的甲醇和水混合作為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)380nm；流速0.3mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量3μL。喹乙醇的質(zhì)量濃度分別一定范圍內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，檢出限(3S/N)為0.015μg/g。以空白豬肉為基體進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率在92.3%～97.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)在1.2%～2.6%之間。結(jié)論：本方法適用于豬肉中喹乙醇的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜法；喹乙醇；殘留量；豬肉

喹乙醇(Olaquindox)是1965年由德國(guó)Bayer公司以鄰硝基苯胺為原料合成的一種抗菌促生長(zhǎng)劑，最初用于防治仔豬腹瀉，1976年歐共體批準(zhǔn)用于畜禽飼料添加劑，國(guó)內(nèi)于1981年研制成功，廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。喹乙醇的毒性隨動(dòng)物種屬不同存在較大差異，特別對(duì)禽和魚類，有中度至明顯蓄積毒性和一定遺傳毒性，對(duì)部分魚類有明顯致畸作用。鑒于此，中華人民共和國(guó)獸藥典明確規(guī)定，喹乙醇作為抗菌促生長(zhǎng)劑，僅限用于35kg以下豬的促生長(zhǎng)，以及防治仔豬黃痢、白痢，豬沙門氏菌感染，休藥期35d；禁用于體重超過35kg以上的豬和禽、魚等其他種類動(dòng)物[1-14]。

1儀器及試劑

1.1　儀器

H-Class超高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；3-30K冷凍高速離心機(jī)：Sigma公司；S XS204電子天平：梅特勒-托利多公司；純水機(jī)：法國(guó)Milli-Q公司；K-1快速混勻器：國(guó)華儀器廠；新佳水浴恒溫振蕩鍋：江蘇省金楊市洪華儀器廠； H127633飛利浦食品加工機(jī)：飛利浦公司。

1.2　試劑

甲醇：色譜純；亞鐵氯化鉀：分析純；乙酸鋅：分析純；喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品：Dr.Ehrenstrfer公司

1.2.1　喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

精確稱取喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g，用少量高純水溶解，并轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度100.00μg/mL。

1.2.2　喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液

取喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10.00mL，轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度10.00μg/mL。此標(biāo)準(zhǔn)使用液需置于棕色容量瓶?jī)?nèi)避光冷藏保存，保存期1個(gè)月，使用時(shí)再用甲醇稀釋至所需濃度。

2試驗(yàn)方法

2.1　樣品提取

取適量粉碎混勻的樣品于50mL離心管中，加10.0mL高純水，漩渦混勻30s，放入恒溫水浴中60℃避光振蕩提取15min[1]。取出加入5.0mL亞鐵氯化鉀和5.0mL乙酸鋅沉淀蛋白，用高純水定容至25.00mL，10000r/min離心10min，避光靜置20min。取上清液過0.22μm微孔濾膜，待測(cè)。

2.2　色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動(dòng)相甲醇(A)+水(B)，梯度洗脫條件見表1[2]；流速：0.3mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：3μL。

2.3　標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

取適量喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液，用流動(dòng)相稀釋成喹乙醇濃度分別為0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。根據(jù)喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.4　回收率和精密度

稱取10g空白樣品，加入不同量的喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，漩渦混勻放置30min后按上述方法進(jìn)行前處理和上機(jī)分析。

3結(jié)果分析與討論

3.1　樣品色譜圖

按色譜條件進(jìn)行分析，圖1為喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，其保留時(shí)間為1.190min，峰型良好。圖2為未添加喹乙醇的豬肉樣品的色譜圖，雜質(zhì)峰和溶劑峰分別在1.00min之前和2.00min之后。圖3為添加0.04μg/mL喹乙醇豬肉樣品色譜圖，喹乙醇保留時(shí)間為1.204min，喹乙醇能良好地和豬肉中的雜質(zhì)分開，說明上述檢測(cè)豬肉中喹乙醇?xì)埩袅康纳V條件和樣品前處理方法是可行的。

圖1　喹乙醇(OLA)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2　未添加喹乙醇(OLA)豬肉樣品色譜圖

圖3　添加0.04μg/mL喹乙醇(OLA)豬肉樣品色譜圖

3.2　標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果及檢出限

分別配制喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線濃度為0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL；1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明喹乙醇濃度在0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL；1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為y=22991x+87.00和y=23240x+39.16，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999，工作曲線如圖4和圖5所示。以10倍信噪比為基準(zhǔn)，經(jīng)實(shí)際加標(biāo)測(cè)得喹乙醇在豬肉中檢出限為0.05μg/g。

圖4　喹乙醇工作曲線圖線性范圍：0.10～2.00μg/mL

圖5　喹乙醇工作曲線圖線性范圍：1.00～20.00μg/mL

3.3　準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)0.10μg/mL，1.00μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果見表2，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%和0.3%。

表2　精密度試驗(yàn)(n=6)

以空白豬肉為測(cè)試對(duì)象，通過由低到高的3個(gè)濃度下加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。另選定加標(biāo)濃度的空白豬肉樣品，連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算批件間精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

表3　空白樣品不同加標(biāo)濃度下的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)

表4　批間精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知在加標(biāo)量為0.10、1.00、2.00三個(gè)梯度下，回收率在92%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也小于10%，結(jié)果表明該方法回收率和精密度可以滿足獸藥殘留檢測(cè)要求。

4討論

喹乙醇極易溶于熱水，所以采用溫水提取喹乙醇。為消除雜質(zhì)對(duì)喹乙醇的干擾及降低檢出限，采用沉淀蛋白的方法，純化提取喹乙醇，經(jīng)過試驗(yàn)研究，該法獲得成功。

喹乙醇見光分解速度很快，要獲得理想的回收率和較低的檢出限，必須對(duì)樣品前處理進(jìn)行全程避光操作，標(biāo)準(zhǔn)使用液要貯存在棕色容量瓶中。

方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行豬肉批量檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]于慧娟,畢士川,黃冬梅. 高效液相色譜測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇的殘留量. 分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2004,20(3):281-283.

[2]梅光明,鄭斌,陳學(xué)昌. 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物的殘留量.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,29(3):254-259.

[3]田蘊(yùn),蔣向君,賀燕,葛敏. 高效液相色譜法測(cè)定豬肉中喹乙醇. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘,2011,27(5):1844.

[4]范偉軍. 復(fù)方制劑中痢菌凈和喹乙醇的含量測(cè)定方法研究. 廣西畜牧獸醫(yī),2001,17(1):6-7.

[5]葉廣茂,鄒偉東,梁華明. 采用等吸收點(diǎn)方法測(cè)定獸藥克痢頓中的喹乙醇含量. 遼寧畜牧獸醫(yī)，2003(3):31-32.

[6]劉同民,權(quán)仁子. 一階導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定促生長(zhǎng)劑中喹乙醇的含量. 中國(guó)獸藥雜志，2000,34(3):30-31.

[7]王文杰. 應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)快速監(jiān)測(cè)預(yù)混添加劑中的喹乙. 飼料研究,1992(10):9-10.

[8]劉安南. 薄層色譜法鑒別中西復(fù)方制劑中喹乙醇成分. 江西飼料, 2001(1):23.

[9]葉紅麗,李濤. 高效液相色譜法用于雞蛋中喹乙醇的檢測(cè). 中國(guó)獸藥雜志.1990, (2):15-17.

[10]艾曉輝,劉長(zhǎng)征,文華. 魚組織中喹乙醇?xì)埩袅扛咝б合嗌V檢測(cè)方研究. 湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003,23(4):266-270.

[11]宮秀杰. 高效液相色譜法測(cè)定飼料中喹乙醇含量. 中國(guó)獸藥雜志,2008,42(10): 32-34.

[12]曾靜,朱寬正,王鵬. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中的喹乙醇. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2006,18(5): 423-425.

[13]張海琪,何中央,徐曉林. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)飼料中喹乙醇?xì)埩袅? 水生態(tài)學(xué)雜志2009,2(1):131-134.

[14]朱學(xué)加. 喹乙醇單克隆抗體制備與初步應(yīng)用研究.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

Determination of olaqunindox residue in pork by ultra high performance liquid chromatography.

LiuChun(CenterforDiseaseControlandPreventionofDongchengDistrictofBeijing,Beijing100009,China)

Abstract:The target analyst was extract form samples with water, involved protein precipitation with zinc acetate and ferrous potassium chloride. Chromatographic column: BEH C181.7μm×50 mm×2.1mm, detection wavelength: 380nm, flow rate: 0.3mL/min, column temperature: 40℃, injection volume: 3μL, and separated with mixtures of methanol and water mixed in different rations as mobile phases. Result: Linear relationships between values of peak area and concentration of olaqunindox was obtained in the definite rages, with detection limits of(3S/N)0.05μg/g. Using samples of blank pork as matrixes, tests for recovery were made by standard addition method, and values of recovery were in rage of 92%-103%, and values of RSD’s (n=6)were in the rage of 1.2%-2.6%. The method is suitable for determination of olaqunindox residue in pork.

Key words：UPLC; olaqunindox; residue; pork

收稿日期：2014-08-08

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.02.010

作者簡(jiǎn)介：劉淳，女，1986出生，檢驗(yàn)士，碩士研究生，主要從事食品理化檢驗(yàn)工作。