NIPT應用于胎兒非整倍體畸形診斷的研究進展

滕　月，劉　丹，黃　譜，李　旭，李春芳

(西安交通大學第一附屬醫院婦產科，陜西 西安 710061)

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NIPT應用于胎兒非整倍體畸形診斷的研究進展

滕月，劉丹，黃譜，李旭，李春芳

(西安交通大學第一附屬醫院婦產科，陜西 西安 710061)

伴隨著1997年于孕婦的外周血中發現胎兒來源的基因片段(cfDNA)以及基因組測序技術、生物信息學技術的不斷進步，無創性產前診斷技術(non-invasive prenatal testing，NIPT)得以迅速發展。NIPT是一項通過分析母血中胎兒染色體成分的分子診斷技術，目前主要應用于胎兒非整倍體畸形(21-三體綜合征、18-三體綜合征及13-三體綜合征)的產前診斷。該文就NIPT技術在產前診斷，特別是在胎兒非整倍體畸形中的研究進展及面臨的挑戰進行總結，以期為產科及遺傳咨詢等相關專業人員提供有益的理論參考。

無創性產前診斷技術；胎兒非整倍體畸形；產前診斷；遺傳咨詢

[Abstract]With the discovery of fetal fraction of cell free DNA (cfDNA) from plasma of pregnant women in 1997 and the extraordinary advancement of whole-genome sequencing as well as bioinformatics, non-invasive prenatal testing (NIPT) develops quickly. As a cellular diagnostic technology testing fetal fraction from plasma of pregnant women, NIPT is mainly applied in prenatal screening and diagnosis of aneuploidy (21 trisomy syndrome, 18 trisomy syndrome, 13 trisomy syndrome). Here we reviewed the progress of NIPT application in fetal diagnosis, especially in aneuploidy, and summarized the progress and challenge in aneuploidy, aiming to provide reference for obstetric and genetic counseling professionals.

[Key words]non-invasive prenatal testing (NIPT)；fetal aneuploidy；prenatal diagnosis；genetic counseling

在過去的幾十年間，對胎兒非整倍體畸形(尤其是21-三體綜合征)的產前診斷取得了一系列引人注目的成就。在上世紀70年代及80年代初期，孕婦年齡(在多數地區被定義為超過35歲)是提示胎兒染色體異常的唯一高危因素，彼時只有不足1/3的唐氏綜合征在產前得到診斷。與此同時，在進行有創產前診斷的孕婦中只有大約2%最終被證實存在胎兒的核型異常，而因羊水穿刺或絨毛取樣而造成的胎兒相關并發癥卻高達0.5%～1%[1]。在80年代晚期及90年代早期，孕中期血清學分子標記物的發現以及“二聯”、“三聯”、“四聯”標記物檢查的應用，顯著地提高了胎兒非整倍體畸形的產前檢出率。在這一時期，接受篩查的孕婦中有大約4%被診斷為唐氏綜合征高危[2]。在隨后的10年間，即90年代晚期及21世紀初期，對于胎兒非整倍體畸形的篩查手段發展為孕早期孕婦血清學檢查[(人絨毛膜促性腺激素hCG)；妊娠相關血清蛋白(PAPP-A)]與孕中期B超檢測[胎兒頸項透明帶厚度(nuchal translucency thickness，NT)]的聯合篩查方式。目前臨床上應用的產前篩查方式將孕早期、孕中期血清學檢測與B超檢測聯合起來，這樣的篩查方式使唐氏綜合征的產前篩出率提高到了90%，且在因篩查結果為高危型而進一步接受有創產前診斷的孕婦中，21-三體綜合征的陽性率也提高到了6%[3-4]。

在1997年，研究者Lo等首次報道在孕婦的外周血中存在非細胞性DNA(cell-free DNA，cf DNA)，后續的研究證實在這些"碎片化"的DNA中有多達10%～20%是胎兒來源[5]。胎兒cf DNA最早可在妊娠第4周的母體外周血中被檢測出來，在孕10周后可在幾乎所有的孕婦外周血中檢出。通常而言，被檢出的cf DNA片段長度約為150bps，而且呈現出的是胎兒全基因組DNA，這一點對于cf DNA被應用于無創性產前診斷是至關重要的[6]。另外，cf DNA的半衰期非常短，在分娩后極短的時間內母血中即檢測不出胎兒cf DNA，這樣的特點使cf DNA同樣可以應用于多孕次孕婦的產前診斷，而不受前一次妊娠時胎兒cf DNA的干擾[7-8]。鑒于上述特點，通過分析母體外周血中cf DNA而進行的無創性產前診斷技術(non-invasive prenatal testing，NIPT)已經在診斷胎兒非整倍體畸形方面顯示出巨大的優勢和發展潛力。

1目前開展的無創性產前診斷技術檢測手段簡介

在開發及應用NIPT技術的過程中，有一個問題不容忽視：即無論是cf DNA還是cf RNA，只占母體外周血中游離性核苷酸的一小部分。因此，目前有一系列研究致力于對母體游離核苷酸中胎兒相關成分進行高效的擴增。這些技術利用胎兒與母體DNA片段大小的差別、DNA與核小體結合的能力、以及對甲基化程度不同的DNA進行免疫共沉淀等特性來對母血中胎兒cf DNA進行擴增，但目前均尚未進入臨床應用階段[6，9-10]。盡管還無法對母血中胎兒cf DNA實現有效擴增，但目前已有數種分子生物學和測序手段應用于臨床，實現對胎兒非整倍體畸形的無創產前診斷。下面將對目前已開展的幾種NIPT手段進行簡要介紹。

2獵槍式大規模并行測序無創性產前診斷技術

通過獵槍式大規模并行測序無創性產前診斷技術(NIPT based on shotgun massively parallel sequencing，s-MPS)，母血中數以百萬計的母體來源與胎兒來源的DNA片段同時被測序，鑒于人類全基因組的基因序列是已知的，因此測序得到的每個DNA片段都可以被定位到某一染色體的特異位置[11]。如果胎兒存在染色體非整倍體，所測序的標本就會出現某一染色體片段計數的相對不足或過剩。由于這種測序方式得到的計數差別很小，為了提高檢測結果的可信性，需要測序標本中核酸片段的拷貝數盡可能多，且胎兒核酸成分占核酸總量的比值盡可能高，并需要將計數結果與正常的整倍體對照組進行比對。

這種測序方式之所以被稱為“獵槍式”，是因為其依賴于對全基因組所有染色體區域測序和計數所得到的信息進行數據分析以作出診斷評價。對于那些無法被定位至染色體特定位點的核酸序列，則被認為是無效的信息。在一些臨床測序應用中，只有與參考基因組序列完全一致的序列才會被定位至特異位點處，而在另一些應用中，與參考基因組序列之間存在1個或者2個堿基錯配的序列也會被接受為有效的序列信息。目前臨床上s-MPS測序多應用Illumina、Solid和Helicos測序平臺進行測序分析。

3靶向大規模并行測序無創性產前診斷技術

與s-MPS對全基因組核酸片段進行測序不同的是，靶向大規模并行測序無創性產前診斷技術(NIPT based on targeted massively parallel sequencing，t-MPS)只選擇性地擴增目標染色體(例如第13、18、21號染色體)的核酸序列，并根據測序結果與整倍體對照組的DNA計數結果差異進行評價診斷。與全基因組測序相比，這種技術所進行的測序量少，從而具有成本相對低廉的優勢。在目前的臨床應用上，該種測序的商業化試劑盒人為地規定了相應的診斷標準，將測序結果與孕婦的年齡結合分析，為受試者提供胎兒患13、18、21-三體綜合征的風險值預測[12]。

4基于單核苷酸多態性的無創性產前診斷技術

DNA多態性也可以應用于NIPT對胎兒非整倍體的診斷。有研究者將配對基于單核苷酸多態性的無創性產前診斷技術(NIPT based on single nucleotide polymorphism，SNP)進行組合，對感興趣的染色體區域進行分析，并通過循環溫度毛細管電泳(cycling temperature capillary electrophoresis)評價SNPs中的胎兒片段和比例。這種方法得到的風險預測值在cf DNA中胎兒成分低至2%時仍具有可信價值，因此在胎兒成分擴增不理想的情況下具有顯著地優勢[13]。

從理論上講，基于SNPs的NIPT技術應該比全基因組測序計數技術更具有優勢。因為SNPs不但能夠提供父母源性的非整倍體信息，還能夠提供基因重組和遺傳性突變的相關信息；但另一方面，鑒于SNPs只占人類全基因組遺傳信息的1.6%，因此若要對由基因多態微小失衡造成的病例進行明確診斷，不但需要對母血中的胎兒DNA進行富集、還需要進一步對核酸片段進行深度測序和高保真度的擴增[14]。利用SNP法進行NIPT診斷可能出現母源性SNP異常的漏診。對于接受第3方供卵的輔助生殖妊娠，在利用SNP法進行NIPT診斷時需要注意，樣本中可能存在來自非代孕母親方的既往妊娠的胎兒同源染色體，因此得到的NIPT診斷結果可能需要因此修正。

5基于DNA甲基化的無創性產前診斷技術

基于DNA甲基化的無創性產前診斷技術(methylated DNA-based NIPT)方法的理論依據是：全基因組中基因表觀遺傳學的差異(包括DNA的高甲基化和低甲基化水平)將會導致基因表型的差別，而且這種差異是與不同組織類型相關的[15]。胎盤細胞(尤其是滋養細胞)中的一些基因與母體細胞的基因在甲基化方式上有所差別。甲基化的DNA可以被化學修飾，因此可以與非甲基化DNA相互區分[16]。也可以利用限制性內切酶消化低甲基化DNA的功能實現對高甲基化DNA的單獨分析[17]。另外，還可以利用甲基化DNA中5-甲基胞嘧啶含量豐富的特征，通過特異性免疫共沉淀技術實現對胎兒非整倍體的NIPT診斷。例如，對于胎盤細胞的21號染色體上一段特異性高甲基化DNA序列的鑒定可以使胎兒來源cf DNA的富集成為可能，并進一步應用于后續的NIPT診斷中[10]。一項利用21號染色體上DNA序列的甲基化水平不同而設計的隨訪研究已經取得了令人鼓舞的結果[18]。目前亦有多項研究聚焦于利用DNA甲基化水平的差異進行NIPT技術的開發應用，如果這一技術被充分開發，其成本將遠低于測序類NIPT，因此具有良好的發展前景。

6無創性產前診斷技術應用面臨的挑戰

6.1對于雙(多)胎非整倍體畸形的無創性產前診斷技術診斷

在利用胎兒cf DNA篩查雙(多)胎妊娠的非整倍體畸形時，存在一些潛在的問題。例如，在生化測序篩查過程中，來自整倍體一方胎兒的染色體序列的正常比例可能會遮蓋住非整倍體一方胎兒的染色體序列比例，從而影響NIPT的正常診斷結果。這樣的情況同樣可能出現在高階多胎妊娠的NIPT診斷中。為了克服這一問題，可以檢測不同基因組間胎兒基因片段的SNPs差異[19]。這一方法可以確定雙胎的合子狀態，對于雙卵雙胎，還可以進一步應用SNPs檢測每一胎兒的DNA片段。

對于雙胎妊娠中一胎胎死宮內而另一胎存活的病例，從理論上講，已經消亡胎兒胎盤來源的殘留物有可能干擾cf DNA的檢測結果；而且，鑒于死胎很有可能是由非整倍體畸形造成的，因此，此類病例的NIPT診斷也極有可能得到假陽性的結果[20]。

6.2無創性產前診斷技術的準確性與成本/收益比

與其他產前篩查手段相比，單次cf DNA檢測的花費高昂，NIPT測序試劑盒于2011年10月首次上市時，在美國的單次篩查費用約為800～2 000美元，在歐洲的費用約為500～1 500美元。隨著測序技術的普及，近年來其價格有所下降。由美國知名測序公司Sequenom開發、于2014年底開始應用于臨床的低成本NIPT診斷服務售價僅為250～300美元[21]。2014年，中國有兩家測序公司，分別為華大科技和達安基因先后獲得國家二代測序儀及無創產前試劑盒注冊，其單次篩查的費用在2 000～3 000元人民幣之間，與Sequenom低成本NIPT診斷服務售價相當。但這一相對高花銷的檢測也僅僅是一種篩查手段，難以做出確定診斷。如何將NIPT與目前臨床應用的其他產前篩查手段有效地整合，也是擺在衛生政策制定者面前的一個課題。目前已發表的關于NIPT的研究多是在非整倍體畸形高危人群中開展的，在低危人群中的相關研究目前剛剛起步，尚缺乏研究數據。在接受篩查的人群中，NIPT的敏感性和特異性均超過95%，假陽性率約為0.1%[22]。鑒于NIPT篩查的高敏感性與特異性，一些學者建議將NIPT作為21-三體綜合征的一線篩查手段[23]；但是，究其本質，NIPT只是一項篩查性檢查，并非診斷性檢查，因為可能無法提供如同胎兒核型分析一樣的精確性和綜合性診斷結果，而對于患方而言，可能其認為這一檢查已經足夠"精確"，并因此放棄進一步的有創性檢查，甚至造成誤診。

關于NIPT成本/收益比的討論也是目前的一個研究熱點。2014年發表的由比利時學者所開展的一項NIPT技術成本/收益比的研究結果顯示：將NIPT作為一線或者二線篩查手段引入產前篩查范圍，可以有效地降低由有創性產前診斷操作所引起的流產等不良事件發生率；與將NIPT作為二線篩查手段相比，NIPT作為一線篩查手段可以進一步降低21-三體綜合征的假陰性診斷結果；但將NIPT作為二線篩查手段可以有效地降低篩查花費；在未來，如果使NIPT應用于所有孕婦篩查的設想具有可實施性，該篩查的單次成本應該低于150歐元(大約相當于1 000元人民幣)[23]。

盡管目前關于NIPT的性價比還有一些爭議，但有理由相信，在未來隨著NIPT價格的進一步降低以及診斷準確率的進一步提高，其臨床應用會有更為廣闊的前景。

6.3無創性產前診斷技術所面臨的法律及倫理挑戰

與其他產前診斷技術一樣，NIPT同樣面臨著來自法律及倫理學等方面的復雜挑戰。例如，從法律的角度而言，對于NIPT的診斷結果以及后續的醫學操作，孕婦本人必然擁有決策權。在一些情況下，鑒于孕婦本人的決策可能會影響到妊娠狀態(如決定是否終止妊娠)，因此又可能與胎兒自身的利益相矛盾。因此，從倫理的角度而言，很難做出一個沒有一方利益犧牲的產前診斷決策。這樣的情況在遺傳學診斷中并不罕見，因為個人的遺傳信息往往是對生物學關系的揭示，從而導致個體間利益的沖突。除了孕婦與胎兒，父方的態度也可能與前二者的利益相悖，從而使妊娠決策變得更加困難。同時，夫妻雙方信息的不對稱或者理解認識水平上的差異也會使妊娠決策陷入倫理困境。

7結語

與其他產前篩查及診斷技術相比，NIPT技術由于其高敏感性、高特異性及無創性等優勢，具有巨大的發展及應用前景。針對我國的現狀，有必要制定相應的國家級指南對NIPT技術的臨床應用進行規范化指導。在NIPT廣泛應用于臨床前，有必要進行NIPT與現行產前篩查手段不同組合的模型研究、充分的經濟學分析以及臨床效應的研究分析。只有這樣，才能確保NIPT應用于胎兒非整倍體畸形診斷的臨床和社會效應。

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[專業責任編輯：于學文]

Current progress on the application of NIPT in diagnosis of fetal aneuploidy

TENG Yue, LIU Dan, HUANG Pu, LI Xu, LI Chun-fang

(Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

2015-07-25

國家自然科學基金資助項目(項目批準號：81402313)

滕月(1983-)，女，醫師，助理研究員，醫學博士，主要從事卵巢癌代謝及轉移方向的研究。

李春芳，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.02.038

R714

A

1673-5293(2016)02-0259-03