KLF4在腫瘤中的最新研究進展

劉海霞，宋　暉，馬　芮， 李　娜， 周福興，陳必良

(第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安 710032)

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【婦幼綜合研究】

KLF4在腫瘤中的最新研究進展

劉海霞，宋暉，馬芮， 李娜， 周福興，陳必良

(第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安 710032)

上皮鋅指蛋白4(KLF4)是一個在多種組織中表達的鋅指結構轉錄因子，包括腸上皮及皮膚組織，它在細胞變異及細胞周期停滯都發揮著重要作用。首先，根據靶基因功能，KLF4既可以激活也可以抑制轉錄作用;其次，在不同的細胞微環境中，KLF4既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為癌基因;再者，KLF4在重組已分化成纖維母細胞為類似胚胎干細胞的可誘導多能干細胞中發揮重要作用。該綜述目的是總結KLF4的生物特性及其與腫瘤發生發展的分子機制最新進展。

上皮鋅指蛋白4；腫瘤；增殖；分化；上皮間質轉化

[Abstract]Krüppel-like factor 4 (KLF4)is a zinc finger-type transcription factor expressed in a variety of tissues, including epithelium of intestine and skin, which plays critical role in differentiation and cell cycle arrest. Firstly, KLF4 can both activate and repress transcription according to target gene. Moreover, KLF4 can be a tumor suppressor or an oncogene resting in different cellular context. Finally, KLF4 is important in reprogramming differentiated fibroblasts into inducible pluripotent stem cells, likely embryonic stem cells. The aim of this review was to summarize biological functions of KLF4 and the latest molecular mechanisms of tumor occurrence and development.

[Key words]Krüppel-like factor 4 (KLF4); tumor; proliferation; differentiation; EMT

Kruppel樣因子(Krüppel-like factor，KLFs)是鋅指成員轉錄因子，它包含C-末端三個C2H2型鋅和N-末端的激活結構域，通過與助激活劑p300的/ CBP與富含GC或CACCC啟動子結合發揮作用。KLFs調節的一系列基因的表達，在許多生物過程中起關鍵作用(如：細胞增殖，分化中和干細胞重新編程)。目前，在人類中已鑒定17個KLFs成員。KLF4作(Krüppel-like factor 4，KLF4)為KLFs家族中的一員，既可結合到CACCC元件也可以結合到其它DNA序列來調節基因的表達?；巨D錄元件(basic transcription element，BTE)是KLF4的高親和力結合位點，其往往在一系列高度保守的基因的啟動子中發現。因為有轉錄激活和抑制的結構域，KLF4可以正負調節其下游靶基因，從而參與于腫瘤的發生發展。

1 上皮鋅指蛋白4生物特性

1.1 上皮鋅指蛋白4結構特點

人和鼠的KLF4的氨基酸長度分別是470和483，可以產生55kDa的蛋白質。KLF4能夠大致分成3個區域：N端激活域、中心抑制區和C端DNA結合域。DNA結合域是由3個連續的鋅指結構組成，每個鋅指結構包含一個反向平行的β折疊、一個端環和一個α螺旋。β折疊上的2個半胱氨酸和α螺旋上的兩個組蛋白共同整合一個鋅離子，以起到穩定折疊的作用。每個鋅指結構通過增加附加鋅指結構從而增加鋅指蛋白的序列特異性，與靶向DNA序列上的3個連續的氨基酸結合。

1.2上皮鋅指蛋白4活化機制

KLF4的一個作用功能是激活靶基因的轉錄。KLF4的N末端含有一個強反式激活域，當直接融合到其3個C端鋅指結構，這個強反式激活域就足以激活合成的報告基因。此外，其N端結構域能與轉錄活化因子前體轉化酶p300/CBP相互作用，這種相互作用是轉錄的必需條件，當發生點突變阻止其與CBP交互作用，KLF4就不能激活轉錄。轉錄活化因子前體轉化酶p300/CBP是組蛋白乙酰轉移酶(Histoneacetyltransferase，HAT)蛋白，p300/CBP增多導致啟動子組蛋白乙?；脑黾?。組蛋白的乙?；铀倭似渌D錄因子和基本轉錄機制的招募。若KLF4在賴氨酸殘基225和229處被p300/CBP乙?；@兩個位點賴氨酸則突變為精氨酸，明顯減弱了KLF4反式激活靶基因和抑制增殖的能力，這表明KLF4的乙?；谄渥饔冒l揮中有重要意義。一項研究發現，KLF4不僅能與有內在組蛋白乙酰轉移酶活性的雙功能輔因子Tip60相互作用，還能招募組蛋白去乙?；?(Histone deacetylase 7，HDAC7)，推測KLF4調節的反式激活機制也許是基因依賴性的。

1.3上皮鋅指蛋白4抑制機制

轉錄因子的抑制機制包括主動抑制和被動抑制[1]。被動抑制就是與轉錄激活因子競爭，與靶基因序列結合而產生的抑制效應。在CYP1A1/HDC和SP1基因序列，KLF4結合一段序列，該序列與激活劑Sp1識別序列重疊，替換啟動子上的Sp1，抑制靶基因。由于Sp1的表達無處不在并且積極調控許多基因，這也很有可能這就是KLF4抑制其多種靶基因的機制。主動抑制就是指KLF4能主動抑制一些基因的表達，或者而不是通過與轉錄激活因子競爭來被動的抑制。GAL4融合實驗表明KLF4除了所熟悉的反式激活域，還有中心抑制區。KLF4通過招募并與HDAC1和HDAC2相互作用抑制CD11d，而KLF4通過招募HDAC3來抑制細胞周期素B1。在TP53基因，MUC1-C招募KLF4、HDAC1和HDAC3來調節抑制。KLF4通過直接競爭與p300結合的Smad3來抑制Smad3介導的PAI-1的活化。最后，KLF4通過與β-catenin/TCF4的直接相互作用，抑制Wnt信號通路的轉錄靶點。這些數據強有力的證明KLF4介導的活化和抑制是復雜且基因依賴性的。

1.4在細胞增殖中的作用

由于KLF4在已分化上皮細胞中作為抗增殖因子表達，KLF4通過減弱或增強抗增殖基因(如p21/wif1/cip1, p53和 E鈣黏蛋白)和促增殖基因(如編碼細胞周期素E1、細胞周期素D1、細胞周期素B1、鳥氨酸脫羧酶和胰島素樣生長因子結合蛋白2)轉錄來調控細胞增殖。KLF4能夠直接獨自或與其他蛋白結合來作用目的基因啟動子的GC富含區域，從而改變特定基因的轉錄。KLF對細胞周期的調節起重要作用，過表達KLF4可使細胞停滯在G1/S期。細胞周期是由細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)所控制，CDKs的活性通過活化劑(細胞周期蛋白)和抑制劑(抑制因子)的控制。在癌細胞中，KLF4通過調節這些激酶、它們的活化因子和抑制因子作用癌細胞的細胞周期。KLF4的組成型表達反作用于主要的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子蛋白(p21，p27及P53)從而抑制DNA 的合成。

1.5 上皮鋅指蛋白4在細胞分化的作用

除了在調節細胞增殖的作用，KLF4也對分化有著重要的調節作用。KLF4中高表達于表皮終末分化層。KLF4在結腸上皮細胞分化中起重要作用。在胃粘膜上皮細胞特異性的KLF4消融小鼠模型中， KLF4的轉錄譜已經表明，KLF4調節一系列上皮特異性的角蛋白的表達。此外，在食管鱗狀上皮，KLF4轉錄上調分化的基因Epstein-Barr病毒的ED-L2和角蛋白4的表達，同時，在胰腺導管細胞，KLF4上調角蛋白19的表達。KLF4在分化中的作用已描述了很長時間，但最近的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)的研究已經確定KLF4作為4個轉錄因子中的一個，通過組合來使體細胞重新編程為iPS。此外，Leng等[2]人證明，在腫瘤干細胞中KLF4過表達僅在球體細胞，在體外和體內敲除腫瘤干細胞KLF4的表達，可顯著減少癌干細胞標記物、耐化學品性、侵襲性、遷移性和腫瘤發生。這些研究揭示KLF4在調節分化與以往的研究存在爭議，因此仍需要進一步的研究。

1.6 上皮鋅指蛋白4參與干細胞的多潛能性

目前，許多研究表明KLF4參與腫瘤干細胞的調節[3]。KLF4可以維持正常干細胞和腫瘤干細胞的端粒酶活性，并在肝細胞長期增殖潛能中起著重要作用[4]。KLF4增強β-catenin的結合力，轉錄端粒酶的反轉錄轉錄酶，表明KLF4在干細胞和腫瘤發生之間的潛在關系[5]。在結腸腫瘤干細胞富集的球狀細胞中，KLF4對維持腫瘤干細胞樣特性起著重要作用，并在DLD-1細胞中起著致癌基因的作用促進結腸癌的發展[2]。此外，KLF4在乳腺癌腫瘤干細胞樣細胞系中表達上調。體內實驗證明：下調KLF4基因可抑制腫瘤的形成，過表達KLF4腫瘤干細胞數量增多[6]。因此，KLF4誘導腫瘤干細胞樣特性可促進侵襲和轉移。下調干細胞抑制性microRNAs可上調KLF4，可調控結腸癌和胰腺癌的腫瘤干細胞樣特性。miR-7可抑制KLF4的表達，減少乳腺腫瘤干細胞樣細胞的腦轉移[7]。令人意外的是，KLF4與SOX2、OCT4以及MYC共同作用可將體壁細胞重塑成腫瘤干細胞樣細胞[8]。最新研究進展表明P53突變可增強KLF4細胞重塑能力。上調變異體壁細胞或P53敲除的細胞內KLF4表達，可在小鼠體內產生侵襲性腫瘤[9]。

1.7 上皮鋅指蛋白4參與上皮間質轉化

近來發現KLF4在上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 的過程中充當上皮基因的轉錄激活者和間充質基因的抑制劑[10]。在肝細胞癌中，外源性KLF4表達抑制間質特征，并改變細胞形態為上皮表型從而抑制細胞遷移和侵襲的活動、腫瘤生長和肺定植。敲除KLF4可增強間質特征和細胞遷移。研究表明KLF4能夠結合并抑制slug啟動子的活性，異位表達slug可部分恢復了KLF4介導的表型。關于KLF4在胃腸道癌癥的EMT中的作用方面文獻有限，但可對KLF4調控非胃腸道癌癥EMT可能帶來靈感。目前關于KLF4在EMT的轉錄調節作用主要集中在乳腺癌。在乳腺癌小鼠模型中，KLF4通過減少snail(EMT與轉移的關鍵中介)的表達，來抑制EMT。

1.8 上皮鋅指蛋白4參與體內穩態維持

結腸組織是由3種主要的分化細胞組成，腸細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞?；钴S增值細胞位于隱窩的基底部并且在其分化過程中向腔面生長，最終脫落。KLF4能抑制擴增并促進分化，表現為KLF4在接近腔面高表達，向陷窩基底部表達逐漸降低。KLF4除了對腸道組織分化起重要作用，有更多的證據表明其外其他組織器官也同樣發揮重要作用。例如，KLF4小鼠由于皮膚表皮屏障的缺陷很快死于脫水，反之，有針對性的過表達KLF4可以導致上皮滲透屏障的早期形成。KLF4的過表達能夠協同增強母體注射型皮質醇加速皮膚屏障形成的作用。這種作用很可能是由于KLF4的目的基因和糖皮質激素受體的重疊。胎兒肺成熟過程中， KLF4可能協同增強糖皮質激素的作用促進胎肺發育。在發育的胚胎，KLF4與Sp1協同增強PSG-5的表達上調，PSG-5是一種通過胎盤分泌到母體中的蛋白。KLF4在前骨髓中的過表達增加了單核細胞標記物的表達，然而KLF4的低表達降低了這些標記物的TPA誘導過表達。KLF4在角膜上皮中高表達，其在角膜上皮的分化中起重要作用。定向刪除眼內的KLF4會導致角膜脆性增加、角膜水腫及結膜杯狀細胞減少。在脂肪細胞分化的細胞培養模型中，siRNA介導的KLF4表達的降低完全阻礙了已分化脂肪細胞數個表型標記物的表達。這些數據強有力的表明了KLF4參與了多種組織的分化過程。

2 在腫瘤中的作用

2.1 上皮鋅指蛋白4作為腫瘤抑制因子

2.1.1胃腸腫瘤

目前，KLF4在胃腸腫瘤中研究最為廣泛，KLF4在胃腸腫瘤中發揮腫瘤抑制作用[11]。KLF4是極少數的在胃腸道腫瘤發生開始表達下調的基因。由于過甲基化和雜合性的丟失，在腫瘤的形成和發展中，KLF4逐漸喪失表達。例如，在以往的研究中，胃癌從I期進展到IV期，KLF4的表達顯著逐步喪失。此外，大多數人的胃癌細胞系同時出現KLF4在mRNA和蛋白水平表達降低。在結腸癌的發展，與結腸腺瘤鄰近的正常黏膜相比，KLF4表達在結腸腺瘤顯著下降。在結腸癌組織微陣列中分析：在癌組織與非癌癥組織相比中，癌組織KLF4的表達顯著降低或失去了表達，KLF4是生存的獨立預測因子。此外，Choi等人(2006年)發現，KLF4表達在正常結腸黏膜表達，而且約1/4的結腸癌中KLF4表達缺失。在食管癌細胞系和組織中也發現KLF4的表達降低。除了這些臨床證據，通過在RKO結腸癌細胞建立一個包含Klf4的的誘導型啟動子的系統，Dang等人(2003年)證實，KLF4的過表達減少腫瘤細胞克隆形成、體內成瘤以及細胞遷移和侵襲。

2.1.2婦科腫瘤

在人宮頸癌，KLF4為腫瘤抑制因子發揮作用。Yang等[12]研究發現，KLF4在宮頸癌中通過抑制細胞增殖和腫瘤形成而作為一種腫瘤抑制因子，在宮頸癌中其功能處于失活狀態。Yang等[13]發現，由于KLF4過甲基化，KLF4表達下調。通過亞硫酸氫鈉測序檢測正常宮頸組織和宮頸癌組織中KLF4啟動子CpG島的甲基化狀態，RT-PCR,免疫組化，western-blot檢測KLF4基因表達狀態以及MTT分析宮頸癌細胞增殖狀態。得出：在宮頸癌中，KLF4基因失活可能是甲基化誘導沉默機制，KLF4啟動子高甲基化抑制其腫瘤抑制因子的功能。

在子宮內膜癌中，敲除致癌基因BMI-1可抑制體外子宮內膜癌細胞增殖和克隆增長，降低化療抵抗類分子KLF4表達[14]。在子宮內膜癌細胞株HEC-1A中，過表達KLF9可誘導KLF4表達[15]。

在卵巢癌中，KLF4起著腫瘤抑制作用。Zohre等[15]研究發現：曲古抑菌素增強KLF4在SKOV3和A549細胞中的表達，KLF4可能通過增強細胞生長抑制、細胞凋亡發揮腫瘤抑制作用。Chen 等[16]證明通過抑制TGF-β誘導的上皮間質化轉移而發揮卵巢腫瘤抑制作用。Yoon等[17]在進展性卵巢癌中，KLF4和Bcl2/Bax表達下調，其調控卵巢癌具體機制仍尚不清楚。

2.2 上皮鋅指蛋白4作為癌基因

盡管KLF4在胃腸腫瘤，婦科腫瘤，肺癌，前列腺癌以及膀胱癌等惡性腫瘤中下調，但在皮膚鱗癌、喉鱗癌和70%乳腺癌中表達卻上調。KLF4在乳腺癌中的作用機制目前存在很大爭議[2]，有研究發現：與正常乳腺上皮細胞比較，乳腺癌細胞KLF4表達丟失，起著抑癌基因的作用。層黏連蛋白B5作為ECM蛋白核纖層蛋白α 的主要組成部分，KLF4可能通過下調層黏連蛋白B5發揮抑癌作用。盡管如此，也有研究發現KLF4在與乳腺癌細胞鄰近的正常的乳腺上皮細胞中低表達，在腫瘤細胞中高表達。KLF4在腫瘤細胞中的高表達定位于乳腺浸潤性導管癌的細胞核，并且核染色體增加預示著表型和預后更差。體外實驗證明，KLF4在皮膚鱗癌表現為致癌基因。在小鼠皮膚基底細胞中強行表達可快速誘導增殖，異型增殖以及鱗癌樣病變。

3展望

KLF4是一個復雜的轉錄因子。根據環境不同，它既可以作為轉錄激活劑，也可以作為轉錄抑制劑，既可以是癌基因，也可以是抑癌基因。KLF4在正常細胞、癌細胞和干細胞重組中發揮這些作用的機制仍不明確。證明抑癌基因和癌基因之間轉換的分子基礎仍需解決。

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[專業責任編輯：張忠明]

Research progress of KLF4 in tumor

LIU Hai-xia, SONG Hui, MA Rui, LI Na, ZHOU Fu-xing, CHEN Bi-liang

(Department of Gynecology and Obstetrics, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Shaanxi Xi’an 710032, China)

2015-09-21

國家自然科學基金資助項目(編號 ：81301921)；陜西省自然科學基金資助項目(編號：2013JM4023)。

劉海霞(1987-)，女，在讀博士，主要從事婦科腫瘤研究。

陳必良，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.02.046

R733

A

1673-5293(2016)02-0282-03