園藝植物扶芳藤葉總黃酮的體外抗氧化活性

邵菁菁+王恒+胡曉倩

摘 ? ?要：通過總黃酮的提取及其對自由基的清除能力研究，可為園藝植物扶芳藤提供新的深層次開發和利用方向。將扶芳藤葉片洗凈烘干至恒質量，粉碎后分別采用石油醚、75%乙醇在索式提取器里回流浸提，然后減壓濃縮提取液，得到扶芳藤葉總黃酮提取物，以蘆丁和Vc為陽性對照，進行體外抗氧化試驗研究。結果顯示，扶芳藤葉總黃酮提取物具有較強的體外抗氧化活性，清除超氧陰離子自由基能力遠遠優于蘆丁和Vc，清除羥基自由基和DPPH·自由基的能力與蘆丁和Vc相當，且在試驗濃度范圍內，清除能力隨扶芳藤葉中總黃酮提取物濃度的增加而呈上升趨勢。研究認為扶芳藤葉可加強作為天然抗氧化劑來源的應用，同時，該研究可為園藝植物扶芳藤具有的藥用保健作用提供機理闡釋的參考。

關鍵詞：扶芳藤;總黃酮;自由基;抗氧化

中圖分類號：Q945 ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.01.009

Antioxidant Activities of the Total Flavonoids from the Horticulture Plant of Euonymus fortunei Hand. Leaves

SHAO Jingjing，WANG Heng，HU Xiaoqian

（College of Life and Environment Sciences， Huangshan University， Huangshan， Anhui 245041， China）

Abstract： In order to provide a new way for the development and utilization of the horticulture plant of Euonymus fortunei Hand.， the extraction of total flavonoids and its scavenging ability on free radicals were studied. Euonymus fortunei Hand. leaves were dried and pulverized to powder， then were extracted in Soxhlet extractor with petroleum ether and 75% ethanol. The extract was concentrated by vacuum and total flavonoids from Euonymus fortunei Hand. leaves were gotten. The antioxidant properties in vitro. of total flavonoids from the leaves of Euonymus fortunei Hand. were studied with rutin and Vc as positive control. The result showed that the total flavonoids from the leaves of Euonymus fortunei Hand. had a good anti-oxidant properties， its scavenging ability of superoxide anion free radical of was much better than that of rutin and Vc， and its scavenging ability of hydroxyl and DPPH· radicals was almost equal to that of rutin and Vc. In the range of experimental concentration， the scavenging capacity raised with the increase of the concentration of the total flavonoids. It is concluded that the leaves of Euonymus fortunei would be enhanced development as natural antioxidants to improve economic value of deep processing. And then， the experiment could provide the basis to clarify the mechanism of medicinal and healthy function of Euonymus fortunei Hand..

Key words： Euonymus fortunei; total flavonoids; free radical; antioxidantion

扶芳藤 （Euonymus fortunei（Turcz.）Hand.-Mzt.），屬衛矛科（Celastraceae）衛矛屬（Euonymus L.），其葉夏季黃綠相間、冬季顏色鮮紅，且能抗SO2、SO3等有害氣體，是優良的彩化綠化園藝植物;其根、莖、葉、果、種子等均可入藥，具降壓、鎮痛抗風濕、改善微循環、抗衰老及提高機體非特異性免疫等藥用和保健功能[1]。摘其莖葉制成茶飲，不僅可以生津止渴，還具保健和藥用價值[2]。動物藥理實驗研究表明，扶芳藤的粗提物及其復合制劑具有明顯的降壓、防治風濕、抗應激、抗心肌缺氧、抗衰老和改善微循環等作用[3-6]。因此，扶芳藤是一種既具觀賞綠化園藝價值，又具藥用、茶飲和保健價值的資源植物。endprint

黃酮是黃酮類天然產物的總稱，具抗腫瘤、提升機體免疫、防動脈硬化、疏通微循環、抗衰老、抗菌抗病毒等多種生理活性及功效[7]。

近年來，衛矛科衛矛屬植物對人體的生理活性已引起國內外學者重視，對衛矛屬植物的化學成分與藥理研究多有報道[8-10]，對扶芳藤的化學成分，如衛矛屬植物中的典型代表成分衛矛醇，還有黃酮類、三萜類、甾醇等的含量和測試方法都有了一定的研究[11-14]，但對具園藝和藥用雙重作用的資源植物扶芳藤，其葉中總黃酮的體外抗氧化活性的研究還未見報道。

本試驗以總氧化還原能力，對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH·自由基的清除能力為評價指標，研究扶芳藤葉總黃酮提取物的體外抗氧化活性，旨在為園藝植物扶芳藤的藥用保健作用機理提供科學闡釋的參考，并為此資源植物的深入綜合開發提供參考數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

扶芳藤植株采自安徽清涼峰國家自然保護區，由黃山學院生命與環境科學學院張慧沖副教授鑒定。

試驗試劑蘆丁（蕓香葉苷·三水烘干至恒質量，無水，純度99.99%）、75%乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鄰二氮菲、PBS（磷酸緩沖鹽溶液）、硫酸亞鐵、DPPH·（二苯代苦味酰基自由基），均為國產分析純。

SXT-02索氏提取器（上海洪紀儀器設備有限公司），RE-52D旋轉蒸發儀（上海青浦滬西儀器廠），HH-S恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫療儀器有限公司），WFZ UV-2100紫外分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 扶芳藤葉中總黃酮化合物的提取工藝 新鮮扶芳藤葉洗凈，60 ℃烘箱中烘干至恒質量后粉碎成粉末。稱取2.5 g扶芳藤葉干粉，濾紙捆扎后放入索氏提取器，加入125 mL石油醚，90 ℃進行回流浸提脫脂約2 h，再加入75%乙醇125 mL回流浸提約5 h，旋轉蒸發器45 ℃減壓濃縮至濃稠果凍狀，得扶芳藤濃縮液，加入少量蒸餾水，煮沸并過濾，得扶芳藤總黃酮化合物的提取液[15-16]。定容至250 mL，冷藏待用。

1.2.2 扶芳藤葉中總黃酮含量的測定 ?（1）標準曲線的制備[17-18]。稱取10.0 mg蘆丁（蕓香葉苷·三水，烘干至恒質量，無水），加入75%乙醇定容至100 mL，配成0.1 mg·mL-1蘆丁標準溶液保存備用。取6支25 mL容量瓶，分別取上述蘆丁標準溶液1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0 mL，加入5%亞硝酸鈉1.0 mL，搖勻并放置6 min。再加入10%硝酸鋁1.0 mL搖勻并放置6 min。最后加入4%氫氧化鈉10.0 mL，并用75%乙醇定容至25.0 mL充分搖勻，放置10 min。以試劑空白做對照，502 nm測定吸光值。每組平行測定4次，取平均值。

以吸光值A（X）為橫坐標，以濃度C（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。得線性回歸方程為：Y（C）=0.125 1X（A）+0.001 3，R2 =0.999 5，線性范圍0.004～0.044 mg·mL-1，線性關系良好（圖1）。

（2）扶芳藤葉中總黃酮化合物含量及提取率計算[17-19]。分別移取3.0，4.0，5.0 mL扶芳藤總黃酮提取液，按照“標準曲線制備”下的操作，測定不同濃度溶液的吸光值，由蘆丁溶液標準曲線計算總黃酮濃度。由下列公式計算總黃酮含量和提取率。

總黃酮含量C（mg·mL-1）=Y×稀釋倍數

總黃酮提取率=[Y×稀釋倍數×V×100%]/1 000W

式中，Y為扶芳藤葉中的黃酮含量（mg·mL-1）;V為原浸提液體積（mL）;W為扶芳藤葉樣品的質量（g）。

1.2.3 扶芳藤葉中總黃酮的總抗氧化還原能力的測定（普魯士藍法） 取扶芳藤葉總黃酮提取液，按照體積比稀釋成5%，10%，20%，30%的總黃酮溶液。以蘆丁溶液和VC溶液（蘆丁溶液、VC溶液濃度與未稀釋的扶芳藤總黃酮提取液的濃度相同）為對照。各取以上溶液1.0 mL，加入pH值6.6磷酸鈉緩沖液2.5 mL，再加入1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL。50 ℃水浴中加熱20 min，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻后移取2.5 mL，分別加蒸餾水2.5 mL和0.1%三氯化鐵2.5 mL，靜置10 min。700 nm測定各溶液的吸光值[20]。各溶液的吸光值越大，說明還原性越強，抗氧化性能越高[21]。

1.2.4 扶芳藤葉中總黃酮對超氧陰離子自由基清除能力的測定（鄰苯三酚自氧化法） ?pH值8.2的Tris-HCl緩沖液6.0 mL，分別加入未稀釋的扶芳藤總黃酮提取液、按照體積比稀釋成1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%的扶芳藤總黃酮提取液、對照蘆丁溶液和VC溶液（蘆丁溶液、VC溶液濃度與未稀釋的扶芳藤總黃酮提取液的濃度相同）各0.5 mL，再加入37 ℃水浴加熱的50 mmol·L-1鄰苯三酚鹽酸溶液0.5 mL，搖勻后靜置4 min，最后加入1.0 mL濃HCl終止反應，322 nm測定各溶液的吸光值。以等體積pH值8.2的Tris-HCl緩沖液為空白對照，吸光度記為A。按照下列公式計算對超氧陰離子自由基的清除率[20]。

O2-·清除率=[A0-A]/A0×100%

式中 ，A0為Tris-Hcl緩沖液的吸光值;A為被測各樣品溶液的吸光值。

1.2.5 ?扶芳藤葉中總黃酮對羥基自由基的清除能力測定（鄰二氮菲-Fe氧化法） 取5 mmol·L-1鄰二氮菲1.5 mL，加入現配制的pH值7.4的磷酸鈉緩沖液4.0 mL，搖勻后加入7.5 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液1.0 mL，分別加入未稀釋扶芳藤總黃酮提取液、按照體積比稀釋成5%，10%，20%，30%的扶芳藤總黃酮提取液、對照蘆丁溶液和Vc溶液（對照蘆丁溶液、Vc溶液濃度與未稀釋的扶芳藤總黃酮提取液的濃度相同）1.0 mL，然后加入1.5 mL蒸餾水，再加入0.1%雙氧水1.0 mL，搖勻后置于37 ℃水浴中加熱1 h，536 nm測定各溶液的吸光值。按照下列公式計算對羥基自由基的清除率[20]。endprint

·OH清除率=A（加）- A（損）/A（未損）-A（損）×100%

式中，A（加）為試驗組中加入樣品或抗氧化劑以及雙氧水;A（損）為試驗組中沒有加入抗氧化劑，只加了雙氧水;A（未損）為兩者都不加。

1.2.6 ?扶芳藤中總黃酮對DPPH·自由基清除能力的測定（DPPH法） （1）DPPH·的配置：精確稱取0.004 g DPPH·，用80%乙醇溶液定容至500 mL，搖勻，即得濃度8 mg·L-1的DPPH·溶液，存于棕色試劑瓶并置于冰箱中冷藏備用。

（2）DPPH·自由基清除能力的測定：分別加入未稀釋扶芳藤總黃酮提取液、按照體積比稀釋成1%，2%，3%，4%，5%，10%，20%，30%的扶芳藤總黃酮提取液、對照蘆丁溶液和VC溶液（對照蘆丁溶液、VC溶液的濃度與未稀釋的扶芳藤總黃酮提取液的濃度相同）2.0 mL;再加入8 mg·L-1 DPPH·溶液2.0 mL;以80%乙醇為空白參比，在517 nm測定各溶液的吸光值A1。取以上各樣品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 80%乙醇溶液，混合搖勻后在517 nm測定各溶液的吸光值A2。取8 mg·L-1 DPPH·溶液2.0 mL，加入80%乙醇2 mL，517 nm測吸光值。按照下列公式計算對DPPH·自由基的清除率[22-23]。

清除率=[ 1-（A1-A2）/ A0 ]×100%

式中，A1 為各樣品溶液與8 mg·L-1 DPPH·溶液混合液的吸光值;A2 為各樣品溶液與80%乙醇溶液混合液的吸光值;A0 為8 mg·L-1 DPPH·溶液與80%乙醇溶液混合液的吸光值。

2 結果與分析

2.1 扶芳藤葉中總黃酮的含量

由蘆丁標準曲線和總黃酮提取率公式計算可得（表1）：扶芳藤葉總黃酮提取液中，總黃酮含量為0.133 mg·mL-1，提取率為1.33%。

2.2 扶芳藤葉中總黃酮的總抗氧化能力

由圖2可知，扶芳藤葉中未稀釋總黃酮溶液的總抗氧化性與同濃度的蘆丁、VC對照溶液總抗氧化能力相當，并且隨總黃酮濃度的增加，其總抗氧化能力增強。扶芳藤葉中的總黃酮具有較好的抗氧化活性。

2.3 扶芳藤葉中總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力

由圖3可知，扶芳藤總黃酮的稀釋液在很低的濃度時，對超氧陰離子自由基的清除作用就遠高于對照樣品蘆丁溶液（0.133 mg·mL-1）;4%的扶芳藤總黃酮的稀釋液對超氧陰離子自由基的清除率就略高于VC溶液（0.133 mg·mL-1）的清除作用。扶芳藤葉總黃酮對超氧陰離子自由基有很好的清除效果，極大優于VC 和蘆丁。

2.4 扶芳藤葉中總黃酮對羥基自由基的清除能力

由圖4可知，隨溶液中總黃酮含量的增加，扶芳藤葉總黃酮對羥基自由基的清除能力增強，并且未稀釋的扶芳藤葉總黃酮（0.133 mg·mL-1）與相同濃度的蘆丁相比，其清除率還高于蘆丁，但略低于VC溶液。因此，扶芳藤葉中總黃酮對羥基自由基有良好的清除作用。

從生物個體角度看，羥基自由基是毒性非常大的一種自由基，其化學性質比較活潑，可以同生物機體細胞中的很多分子產生化學反應，因而導致機體損害[24]。此試驗表明，扶芳藤葉中的總黃酮可通過良好的清除羥基自由基能力來行使抗氧化功能。

2.5 扶芳藤葉中總黃酮對DPPH·自由基的清除能力

由圖5可知，扶芳藤葉總黃酮對DPPH·自由基有顯著的清除作用，并且隨總黃酮濃度的增加，清除率隨之增大。其中，未稀釋的扶芳藤葉總黃酮對DPPH·自由基清除率高達92.69%，其清除能力高于相同濃度的蘆丁溶液，與相同濃度的VC溶液相當。

3 結論與討論

自由基的含量與生物體的多數功能紊亂和疾病的出現有關。生物機體內的自由基是處于連續的產生與清除的穩定動態平衡狀態之中，當這種動態平衡被打破時，機體內的自由基含量增多或是其本身的抗氧化能力減弱時，則可引發機體損傷[25]。因此，探討抗氧化物質對自由基的清除作用以及效果具有重要意義。

超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）、DPPH·是能夠引起機體損傷病變的常見自由基。本試驗以蘆丁和Vc作為對照，研究了扶芳藤葉中總黃酮提取物的體外抗氧化性能。試驗結果表明，扶芳藤葉總黃酮提取物可以有效地清除超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH·自由基，其中，清除超氧陰離子的能力遠遠優于蘆丁和Vc，清除羥基自由基和DPPH·自由基能力與蘆丁和Vc相當，因此，扶芳藤葉總黃酮具有較好的體外抗氧化活性。

具有園藝和藥用雙重價值的資源植物扶芳藤，其育種和栽培容易完成。扶芳藤的莖葉不僅可以作為傳統中藥材入藥，還可以從中提取總黃酮，今后應加強抗氧化劑產品的開發，提高扶芳藤葉深加工的經濟價值和扶芳藤植株的綜合開發價值。

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